规模化羊场羔羊腹泻防治技术规范

1规模化羊场羔羊腹泻防治技术规范本文件规定了规模化羊场羔羊腹泻病的诊断和防治。本文件适用于养羊场（户）、动物疫病预防控制机构和兽医诊疗单位等对羔羊腹泻病的防控。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T14926.1实验动物沙门菌检测方法GB/T27982小反刍兽疫诊断技术GB/T47130牛冠状病毒感染诊断技术SN/T5225进出口食品中五种致泻大肠埃希氏菌快速检测方法多重PCR法DB15/TDB15/T2728DB15/T3438DB15/T3442DB15/T3681产气荚膜梭菌分离与鉴定操作规程羊链球菌病诊断技术规模化奶山羊场球虫病防治技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1羔羊腹泻lambdiarrhea由致病性微生物、寄生虫感染，以及饲养管理不当、环境应激等多种因素共同引起，发生于羔羊的一种以消化不良、腹泻为主要临床症状，可伴随脱水、自体中毒等并发症的消化道疾病综合征。4流行特征本病多见于3月龄内羔羊，尤以2月龄以内羔羊发病率最高；一年四季均可发生，其中冬季气温偏低时多发，夏季高温高湿环境下也可出现局部流行。5传播途径传播途径主要为消化道传播，可通过污染的饲料、饮水、垫草、哺乳用具及饲养人员接触传播；部分病原可通过母羊垂直传播给新生羔羊。26临床特征病羔羊可表现为以下一种或多种临床特征，按症状类型分为：——全身症状：精神沉郁、体温升高、废食、呼吸短促，严重时出现自体中毒、心力衰竭。细菌性腹泻多伴随体温明显升高、粪便带血丝或黏液；寄生虫性腹泻多为慢性腹泻，粪便经显微镜检查可见虫卵、卵囊或虫体，体温基本正常；——消化道症状：腹胀、腹痛、腹泻，粪便性状及颜色多样，恶臭，间或混有血丝、气泡，严重时呈血水样；——脱水症状：被毛粗乱无光泽、皮肤弹性下降、眼窝下陷，严重时躺卧不起、四肢发凉。7诊断7.1非感染因素分析本病诊断首先要考虑饲养管理不当、饲料配比失衡、环境因素、应激因素和微量元素缺乏导致的腹泻。在此基础上，进行病原检测。7.2病原诊断7.2.1细菌性病原诊断7.2.1.1样品采集与处理7.2.1.1.1粪拭子用拭子刮取肛门内或地上新鲜粪便，放入装有不含抗生素的PBS或生理盐水的5mL冻存管中，编号、记录。2℃~8℃保存，24h内运回实验室进行检测。7.2.1.1.2组织样品将病羊剖检后取肠内容物、肠黏膜刮取物、肠管、肠系膜淋巴结、肝脏等组织样本，编号、记录。2℃~8℃保存，24h内运回实验室进行检测。7.2.1.2细菌的分离7.2.1.2.1粪拭子的分菌将拭子样品至于20mL无菌生理盐水中旋涡混匀30s，静置1min。吸取50μL上层液体，均匀涂布在麦康凯琼脂培养基（见附录A中A.1）、伊红美蓝琼脂培养基（见附录A中A.2）、TSC琼脂培养基（见附录A中A.3）、哥伦比亚CNA血琼脂培养基（见附录A中A.4）及SS琼脂培养基（见附录A中A.5）上。倒置于37℃培养16h后观察菌落形态。7.2.1.2.2组织样品的分菌用经火焰灭菌并冷却的接种环蘸取病料内部组织后划线接种于麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基、TSC琼脂培养基、哥伦比亚CNA血琼脂培养基及SS琼脂培养基，倒置37℃培养16h后观察菌落形态。7.2.1.3核酸检测3将培养的菌落进行处理，按细菌基因组核酸提取试剂或试剂盒方法提取核酸：——按照SN/T5225对致泻性大肠埃希菌（ETEC、EHEC、EIEC、EPEC、EAEC）进行PCR检测；——按照DB15/T3438对产气荚膜梭菌进行PCR检测；——按照DB15/T3442对羊链球菌进行PCR检测；——按照GB/T14926.1对沙门菌进行PCR检测。7.2.2病毒性病原检测7.2.2.1样品采集7.2.2.1.1粪拭子用拭子刮取肛门内或地上新鲜粪便，放入含有青霉素(100IU/mL)和链霉素(100μg/mL)的PBS或生理盐水保存液的5mL冻存管中，编号、记录。2℃~8℃保存，24h内运回实验室进行检测。7.2.2.1.2组织样品将病羊剖检后取肠内容物、肠管、肠系膜淋巴结、脾脏等组织样本，编号、记录。2℃~8℃保存，24h内运回实验室进行检测。7.2.2.2病毒的分离7.2.2.2.1样品处理将拭子样品与保存液充分混合后，吸取上清液经0.45μm滤膜过滤后备用。组织样品充分研磨后加5mL含有青霉素（100IU/mL）和链霉素（100μg/mL）的PBS缓冲液混匀，高速冷冻离心机8000r/min，4℃离心5min，取上清液经0.45μm滤膜过滤后备用。7.2.2.2.2接种细胞小反刍兽疫病毒接种于表达犬SLAM的Vero衍生细胞、非洲绿猴肾细胞或者羔羊原代肾/肺细胞中，轮状病毒、冠状病毒分别接种于MA104细胞或HCT-8细胞，于37℃、5%CO2培养箱中静置培养。每天观察细胞状态并记录，连续观察4d～5d。出现细胞病变效应（CPE）的细胞，反复冻融3次，利用高速冷冻离心机3000r/min，4℃离心10min，取上清液冻于-80℃冰箱中备用。若4d～5d未出现CPE的，继续盲传3代。将出现细胞病变效应的细胞悬液反复冻融3次，3000r/min离心10min，吸取上清液，于-80℃冰箱保存待检。7.2.2.3核酸检测按病毒RNA提取试剂或试剂盒方法提取核酸：——按照GB/T27982对小反刍兽疫病毒进行RT-PCR检测；——按照DB15/T2728对轮状病毒进行RT-PCR检测；——按照GB/T47130对冠状病毒进行RT-qPCR检测。7.2.3寄生虫性病原检测采用饱和盐水漂浮法从新鲜粪便中富集寄生虫卵囊或虫卵，经姬姆萨染色或墨汁染色后，制备卵囊抹片，置于显微镜下观察；若镜检发现球形或卵圆形的卵囊，结合临床症状，可诊断为寄生虫性腹泻。同时，可辅助采用粪便离心沉淀法，提高卵囊检出率。48.1产羔管理8.1.1产前7d～10d对产房进行彻底清洁、消毒，并保持干燥、保暖。8.1.2新生羔羊脐带留存长度约5cm～7cm，且用7%～10%碘酊浸泡30s完成消毒，48h后再次进行脐带消毒。8.2饲喂管理8.2.1对哺乳母羊，乳头彻底消毒并挤去头两把奶，防止致病微生物传给羔羊。8.2.2羔羊岀生后2h内吃足初乳，做到早吃、勤吃。有条件牧场应按照初生羔羊体重的8%，人工哺喂母羊产后6h内的高品质初乳，奶温在37℃~42℃,饲喂7d。8.2.3哺乳壶、桶、奶嘴等哺乳用具要严格用开水煮沸或消毒药消毒并清洗晾干。8.2.4人工哺育羔羊可使用羔羊专用代乳粉且应保证一羊一奶嘴，不应连续交叉使用。8.2.515日龄饲喂开食料，锻炼羔羊胃肠功能。必要时补充硒，防止因饲料缺硒造成腹泻死亡。8.3环境管理8.3.1创造羔羊良好生活环境，冬季铺设垫草（夏季铺设垫沙）厚度30cm，定期更换粪尿污染的垫草，每隔3d对羔羊栏进行喷雾消毒一次；补饲槽、饮水槽保持清洁，定期消毒；断奶后对羔羊舍进行彻底清理、消毒、晾晒。8.3.2在保证舍内通风的前提下，保证羔羊舍干燥、卫生、舒适、温暖。8.3.3采用小群饲养，群体饲养的羔羊应是健康羊只，不应有腹泻、肺炎、脐带炎等疾病的羊只。8.4免疫管理应根据当地疫病流行情况合理制定免疫程序进行免疫。必要时在产前对妊娠母羊实施免疫。羔羊出生后1～2月按免疫程序进行免疫。9临床管理9.1管理原则坚持早诊断，早隔离，早治疗，早处理的原则。9.2羔羊腹泻及脱水程度评级见附录B。9.3对症治疗9.3.11级和2级腹泻，体温升高，根据病原检测及药敏试验结果合理选用敏感药物进行治疗。9.3.23级和4级腹泻，需要静脉补液，并根据病原检测及药敏试验结果合理选用敏感药物进行治疗，用药须遵守兽药使用规范。5对于诊断为病毒9.3.3感染的，应采取补液、强心、止泻和防止细菌继发感染等措施治疗患病动物。对于诊断为寄生9.3.4虫感染的，按照DB15/T3681进行治疗。9.3.5若体温正常，多为非感染性腹泻，无需使用抗生素，可选用益生菌、蒙脱石散等，调节胃肠功能，缓解腹泻症状。9.4补液9.4.1补液的主要成分为碳酸氢钠和葡萄糖生理盐水注射液，根据脱水状况，调节补液速度，纠正休克和机体酸中毒，同时补充各种维生素和能量。9.4.2补液量：——轻度脱水：口服补液盐，每次50mL～100mL，每天3～4次；——中度脱水：静脉或腹腔注射生理盐水或5%葡萄糖溶液，每次100mL～200mL，分2次补——重度脱水：立即静脉注射补液，每次200mL～300mL，同时补充电解质，必要时配合强心药物。10无害化处理病死或死因不明的羔羊无害化处理应符合《病死及病害动物无害化处理技术规范》及《病死畜禽和病害畜禽产品无害化处理管理办法》的相关规定，及时进行焚烧、深埋等无害化处理，严禁随意丢弃；处理后，对羔羊舍、饲养用具、周边环境进行彻底喷雾消毒，防止病原扩散。6（资料性）培养基的配置方法A.1麦康凯琼脂培养基基础成分见表A.1。表A.1基础成分乳糖，g氯化钠，g琼脂，g取上述成分除琼脂，混合，微热溶解，调节pH值至7.4±0.2，加入琼脂，加热融化后，分装，121℃高压灭菌15min，并在无菌操作要求下倾注至无菌平皿中，制备好的培养基平皿宜在2℃~8℃保存。A.2伊红美蓝琼脂培养基基础成分见表A.2。表A.2基础成分乳糖，g磷酸氢二钾，g伊红，g美蓝，g琼脂，g取上述成分除琼脂，混合，微热溶解，调节pH值至7.1±0.2，加入琼脂，加热融化后，分装，121℃高压灭菌15min，并在无菌操作要求下倾注至无菌平皿中，制备好的培养基平皿宜在2℃~8℃保存。A.3胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基（TSC琼脂）基础成分见表A.3。表A.3基础成分胰胨，g大豆胨，g酵母浸粉，g焦亚硫酸钠，g柠檬酸铁铵，g琼脂，g7取上述成分加热溶解于1000mL蒸馏水中，分装于500mL烧瓶中，每瓶250mL，121℃高压灭菌15min。冷至（50±1）℃时，每250mL培养基中，加入过滤除菌的0.5%D-环丝氨酸溶液20mL，混匀，在无菌操作要求下倾注至无菌平皿中，制备好的培养基平皿宜在2℃~8℃保存。A.4哥伦比亚CNA血琼脂培养基基础成分见表A.4。表A.4基础成分胰酪蛋白胨，g植物组织蛋白消化液，g酵母提取物，g玉米浸粉，g琼脂，g萘啶酮酸，g脱纤维羊血，g取上述成分除脱纤维羊血，加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH值至7.3±0.2，加入琼脂，加热融化后，121℃高压灭菌15min，冷至50℃左右时，每200mL培养基中加入10mL无菌脱纤维羊血，并在无菌操作要求下倾注至无菌平皿中，制备好的培养基平皿宜在2℃~8℃保存。A.5沙门氏菌-志贺菌琼脂培养基（SS琼脂）基础成分见表A.5。表A.5基础成分䏡胨，g乳糖，g三号胆盐，g枸橼酸钠，g硫代硫酸钠，g枸橼酸铁，g煌绿，g