【细胞死亡机制及细胞形态的研究进展的文献综述4600字】

细胞死亡机制及细胞形态的研究进展的文献综述细胞死亡、存活、增殖和分化代表生命的基本过程。细胞死亡在胚胎发育、维持生物体的稳态和消除受损细胞中起着关键作用。细胞死亡最初分为三种类型：I型细胞死亡（凋亡）、II型细胞死亡（自噬）和III型细胞死亡（坏死）[1]。近年来，已经鉴定并表征了多种新的细胞死亡方式，其中涉及它们相应的刺激因素、分子机制和细胞形态。这些新的细胞死亡方式具有不同的信号通路，并且未能纳入I-III类细胞死亡类型。2018年，细胞死亡命名委员会以分子为导向的方式列出了多种细胞死亡类型[2]。Tang等人还提供了在细胞死亡研究过程中各种细胞死亡方式的历史起源以及参与调控细胞死亡的分子机制的简要总结[3]。Fig.1.1Classificationofcelldeath.Itisclassifiedaccordingtomorphologicalcharacteristicsandmolecularmechanisms.细胞死亡可根据其信号依赖性分为程序性或非程序性细胞死亡（Fig.1）。程序性细胞死亡（PCD）是由严格调控的细胞内信号转导途径驱动的。相反，由于意外的细胞损伤导致的细胞死亡被称为非PCD。鉴于细胞形态特征和分子机制，PCD可进一步分为凋亡性细胞死亡和非凋亡性细胞死亡。凋亡保持细胞膜完整性，并以半胱天冬酶依赖性方式发生。相比之下，非凋亡细胞死亡的主要特征是膜破裂和不依赖半胱天冬酶。在肿瘤临床治疗中，细胞凋亡诱导剂并不总是有效的治疗策略，因为肿瘤细胞倾向于对细胞凋亡产生多种抵抗机制，因此需要研究诱导细胞凋亡的替代途径以改进诱导肿瘤细胞死亡的策略（Table1.1）[4]。本章节侧重于表述研究中常用的多种细胞死亡方式的关键特征及其评估方法。Table1.1Celldeathmodeandmorphologicalcharacteristics死亡方式参与分子形态学特点坏死无细胞肿胀、膜破裂、细胞器丢失凋亡Bax、Bak、AIF、caspase-8、caspase-3、caspase-9细胞收缩、膜起泡、细胞质中细胞器位置组织的丧失、DNA缩合自噬UKL1、PI3KIII、ATGs、LC3大的细胞内囊泡、膜起泡、扩大的细胞器、细胞质细胞器耗竭巨泡性死亡Ras、Rac1、Arf6、LAMP1、Rab7大量充满液体的单膜液泡的积累、细胞肿胀、膜破裂旁凋亡未知大量充满液体的单膜液泡的积累；内质网或线粒体扩张铁死亡SystemXC−、GPX4、LipidROS线粒体体积缩小，嵴塌陷和膜破裂焦亡NLRs、ALRs、caspase-1、caspase-11细胞肿胀、膜破裂、DNA浓缩和断裂坏死性凋亡DRs、TLRs、TCR、RIPKs、MLMK细胞肿胀、膜破裂、细胞器丢失、线粒体肿胀1.1.1非程序性死亡-坏死（necrosis）最初，坏死一词用于描述不可逆的组织损伤，这种损伤显然发生在涉及的细胞已经死亡之后[5]。目前，坏死用于表述一种非程序化的细胞意外死亡。与凋亡相反，坏死是细胞死亡的一种被动形式，没有细胞凋亡所特有的复杂的调节机制。通常，损伤的强度和细胞的能量水平决定了细胞凋亡或坏死。可以表明，低ATP浓度或ATP生成受损将细胞死亡的形态推向坏死[6,7]。细胞坏死受到许多外部因素的刺激，例如感染、毒素和物理损伤，导致细胞形态学改变，例如细胞质肿胀，质膜破裂和胞内细胞器丢失，没有严重的染色质浓缩，但DNA会随机降解[8,9]（Fig.1.2）。相对于凋亡，细胞坏死细胞的细胞膜很早就变得可渗透，可以检测乳酸脱氢酶（LDH）活性来证明细胞渗漏和膜通透性的变化。同时还可以采用不能穿过细胞膜的小分子染料如碘化丙啶、单或二聚花菁核酸染料（YOPRO-1）以及其他几种染料检测膜的通透性。这些染料对DNA和RNA有很高的亲和力，结合导致它们的荧光增强，这使得它们适合于活细胞成像。值得注意的是，由于继发性坏死，凋亡晚期的细胞也可通过所有这些染料渗透膜。Fig.1.2.Typicalmorphologicalcharacteristicsofcelldeathmodes[10].1.1.2程序性死亡1.1.2.1凋亡（Apoptosis）细胞发生凋亡时，细胞以时间和空间严格调控的序列激活多种蛋白质。凋亡的启动是由各种刺激引起的，包括配体与肿瘤坏死因子家族的细胞表面受体的结合，各种应激因素如药物、辐射或细胞稳态的重大变化对DNA完整性产生破坏，进一步诱导下游信号通路的激活和效应蛋白的相互作用[11]。细胞凋亡的特征是细胞收缩、膜起泡、DNA浓缩和断裂（Fig.2）。已知三种信号通路可触发细胞凋亡：外源性（死亡受体）途径、内源性（线粒体）途径和穿孔素/颗粒酶途径[12]。其中内源性途径是研究最多的信号通路，Caspase级联反应的激活是细胞凋亡过程中最重要的步骤，Caspase可以启动凋亡信号（caspase-8和-9）并执行凋亡程序（caspase-3，-6，-7）。随着效应caspases的激活，导致细胞凋亡的线粒体通路被激活。凋亡级联反应激活后，一些重要的蛋白质被裂解。从细胞开始死亡到最终细胞破碎，通常需要几个小时，但时间取决于细胞类型、刺激和凋亡途径。目前发展了很多细胞凋亡的研究方法，末端脱氧核苷酸转移酶dUPT缺口末端标记（TUNEL）测定和彗星电泳测定能够检测片段化DNA的存在。膜联蛋白V（AnnexinV）与PI染色染料结合用于检测细胞膜上向外暴露的磷脂酰丝氨酸和细胞完整性。以及半胱天冬酶测定和聚ADP核糖聚合酶（PARP）裂解测定。此外，特定的细胞凋亡抑制剂，如泛半胱天冬酶抑制剂z-VAD-fmk也可以证实细胞凋亡的存在。1.1.2.2自噬（Autophagy）自噬依赖性细胞死亡是一种依赖于自噬机制的程序性细胞死亡[13]。自噬反应（在严格的转录和翻译后调控下）最常在适应压力过程中起作用，因此介导细胞保护（而不是细胞毒性）效应[14]。因此，用药物或基因干预阻断自噬通常会加速（而不是延迟）细胞对应激反应的死亡，自噬中永久性或暂时性内源性缺陷与胚胎致死、发育缺陷和多种病理疾病有关[15]。然而，在许多发育和病理生理环境中，自噬的分子机制在病因上有助于细胞死亡[16]。自噬性细胞死亡的特征是细胞内出现大的囊泡、质膜起泡、细胞器增大以及在没有染色质凝聚的情况下细胞器发生耗竭（Fig.2）[17]。值得注意的是，它在细胞过程中起到了调节作用，自噬是在细胞应激时作为保护性反应启动的，一旦细胞压力不可逆转，细胞也会通过过度的自噬水平走向死亡。自噬分为三种形式：巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬[18]。巨自噬过程已被研究的较为充分[19-21]。在微自噬中，细胞质成分被直接隔离到溶酶体中，其中酸性水解酶进一步介导成分降解。伴侣介导的自噬选择性靶向含有KFERQ基序（Lys-Phe-Glu-Arg-Gln）的蛋白质，这些蛋白质可以被分子伴侣识别，随后被劫持到溶酶体中并最终降解[22]。目前自噬的检测方法主要是针对巨自噬的，包括通过蛋白质印迹、荧光显微镜和流式细胞术测定自噬特异性蛋白的表达[23]。1.1.2.3巨泡性死亡（Methuosis）巨泡性死亡是一种新的细胞死亡方式，其特征是存在大量来自巨泡饮的充满液体的单膜空泡，一般伴随着Ras过度激活和细胞凋亡障碍。随后的细胞形态类似于细胞肿胀和质膜完整性丧失的坏死（Fig.2）。在巨泡性死亡中，激活的Ras通过激活下游Rac1来刺激细胞胞饮作用。巧合的是，ADP核糖基化因子6-GTP（Arf6-GTP）的减少阻碍了内体再循环[24]。新生内体的异常聚集引起大量细胞质空泡化，无法缓解的巨大液泡最终会导致细胞死亡。1.1.2.4旁凋亡（Paraptosis）旁凋亡的标志是来自内质网或线粒体肿胀导致的细胞质空泡化[25]（Fig.2）。据报道，胰岛素样生长因子1受体（IGF1R）及其下游信号包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和JNK通路的激活能够诱导旁凋亡，尽管IGF1R通常被认为是促生存调节剂[26]。许多研究表明，旁凋亡与活性氧（ROS）的产生和内质网中错误折叠蛋白的积累以及线粒体Ca2+超载相关[27-30]，导致线粒体和内质网渗透压升高，肿胀空泡化，但尚未完全解决其具体的分子机制。目前主要通过电子显微镜检测到的多个单膜细胞质液泡的出现来定义旁凋亡[31]。1.1.2.5铁死亡（Ferroptosis）与细胞凋亡、自噬细胞死亡和坏死性凋亡不同，铁死亡是一种铁和脂质过氧化依赖的、半胱天冬酶非依赖的细胞死亡的模式[32,33]。胞内过量的铁通过芬顿反应产生ROS导致铁死亡。铁通过转铁蛋白受体1（TFR1）以三价铁（Fe3+）的形式输入，位于内体的Fe3+被STEAP3酶还原为亚铁（Fe2+），Fe2+在金属转运蛋白1（DMT1）的介导下释放到细胞质中[34]。铁死亡的外观与正常细胞形态相似，具有完整的细胞膜，膜不起泡，细胞核大小正常，染色质未见凝聚，但线粒体体积减小、嵴减少、膜塌陷和破裂（Fig.2）[35]。Erastin和RSL3是RAS选择性致死小分子，对携带致癌RAS基因的肿瘤细胞具有选择性[36,37]。Erastin直接靶向电压依赖性阴离子通道2和3（VDAC2/3），并通过直接抑制胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白（SystemXC−）活性降低谷胱甘肽（GSH）水平[33]。抗氧化剂（α-生育酚、丁基化羟基甲苯和β-胡萝卜素）、铁螯合剂（去铁胺）、维生素E和Ferrostatin-1可以显著逆转由Erastin引起的细胞脂质ROS积累[109]。与Erastin不同，RSL3以不依赖于VDAC的方式激活，通过直接结合或消耗GSH使GPX4失活，导致脂质过氧化快速产生ROS[38]。同时还可以测量脂质过氧化物（C11-BODYPY）来表征铁死亡。1.1.2.6焦亡（Pyroptosis）细胞焦亡是由各种病理刺激（如微生物感染、心脏病发作、中风和癌症进展）引发的受调节的炎症性细胞死亡[39]。激活的caspase-1通过GasderminD的裂解介导膜孔的形成，从而使细胞膜破裂[40]。该过程还伴随着DNA浓缩和断裂（Fig.2）。此外，caspase-11可以直接被细菌脂多糖（LPS）激活并诱导细胞焦亡[41]。细胞焦亡可以通过量化释放的LDH，通过荧光显微镜观察膜完整性，通过蛋白质印迹检测白细胞介素-1β和GasderminD的裂解来验证[42]。1.1.2.7坏死性凋亡（Necroptosis）坏死性凋亡，也称为程序性坏死，其特征是通过多种信号通路激活受体相互作用蛋白激酶（RIPK）[43]。各种细胞表面受体募集形成大分子复合物时被激活RIPK，包括：死亡受体（DR）、Toll样受体（TLR）和T细胞受体（TCR）[44,45]。RIPK1和RIPK3是坏死体的关键成分，RIPK3通过磷酸化进一步激活下游分子混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL），从而导致MLKL寡聚化[46-48]。寡聚化的MLKL插入并渗透细胞膜，最终导致细胞死亡[49]。此外，在病毒感染或存在双链病毒DNA后，细胞溶质DNA传感器、DNA依赖性干扰调节因子也会触发RIP3依赖坏死性凋亡[50]。坏死性凋亡显示坏死形态，膜破裂和细胞器丢失（Fig.2）。坏死性凋亡可以通过细胞不可渗透的DNA结合染料检测质膜完整性，通过蛋白质印迹检测细胞内容物的释放，包括LDH、高迁移率族蛋白1（HMGB1）和亲环蛋白A，以及使用坏死性凋亡特异性抑制剂，例如necrostatin-1来验证坏死性凋亡[51]。1.1.3小结大自然是天然产物取之不尽的来源，其中具有预防和治疗功能的化合物已在临床中用于治疗多种疾病[52-57]。迄今为止，研究由天然化合物引发的细胞死亡的分子机制主要关注细胞信号过程，而很少关注形态变化。天然产物至今仍是大量未开发的活性分子的来源[58-64]。最近，基于传统医学知识导向的活性化合物提取、天然产物纯化和化学修饰，以增加传统药物的治疗潜力。最终目标是在体外评估这些分子，以确定它们的分子靶点和生物活性，并期望其能够解决临床上的疾病。仅基于诱导细胞凋亡的治疗方法会因耐药机制的激活而导致许多治疗失败，从这个意义上说，最近发现的促进肿瘤细胞其他死亡途径肯定会改善癌症治疗方式。同时将促凋亡的药物和促非典型细胞死亡方式的化合物联合应用将带来更好的治疗效果，并可能成为未来流行的新的治疗途径。参考文献[1]A.Ito,R.Kasai,K.Yamasaki,H.Sugimoto,AliphaticandaromaticglucosidefromAnoectochiluskoshunensis,Phytochemistry,33(1993),1133-1137.[2]C.X.Qi,Q.Zhou,Z.Yuan,Z.W.Luo,C.Dai,H.C.Zhu,etal.,Kinsenoside:APromisingBioactiveCompoundfromAnoectochilusSpecies,CurrentMedicalScience,38(2018),11-18.[3]M.Xiang,T.Liu,W.Tan,H.Ren,H.Li,J.Liu,etal.,Effectsofkinsenoside,apotentialimmunosuppressivedrugforautoimmunehepatitis,ondendriticcells/CD8+Tcellscommunicationinmice,Hepatology,64(2016),2135-2150.[4]Z.L.Liu,Q.Liu,B.Xiao,J.Zhou,J.G.Zhang,Y.Li,ThevascularprotectivepropertiesofkinsenosideisolatedfromAnoectochilusroxburghiiunderhighglucosecondition,Fitoterapia,86(2013),163-170.[5]Y.H.Zhang,S.D.Li,G.Q.Wang,Y.Otsu,Z.Y.Wang,BiologicalcontrolofsoybeanSclerotiniarotwithwettablepowderofGliocladium,ActaPhytopathol.Sin.,33(2007),141-142.[6]K.T.Cheng,Y.S.Wang,H.C.Chou,C.C.Chang,C.K.Lee,S.H.Juan,Kinsenoside-mediatedlipolysisthroughanAMPK-dependentpathwayinC3H10T1/2adipocytes:RolesofAMPKandPPARαinthelipolyticeffectofkinsenoside,Phytomedicine,22(2015),641-647.[7]X.M.Du,N.Y.Sun,T.Tamura,A.Mohri,M.Sugiura,T.Yoshizawa,etal.,HigheryieldingisolationofkinsenosideinAnoectochilusanditsanti-hyperliposiseffect,BiologicalandPharmaceuticalBulletin,24(2001),65-69.[8]H.-B.Hsiao,J.-B.Wu,H.Lin,W.-C.Lin,KinsenosideIsolatedfromAnoectochilusFormosanusSuppressesLPS-StimulatedInflammatoryReactionsinMacrophagesandEndotoxinShockinMice,Shock,35(2011),184-190.[9]X.M.Du,N.Y.Sun,Y.Chen,N.Irino,Y.Shoyama,HepatoprotectivealiphaticglycosidesfromthreeGoodyeraspecies,BiologicalandPharmaceuticalBulletin,23(2000),731-734.[10]X.M.Du,N.Irino,N.Furusho,J.Hayashi,Y.Shoyama,PharmacologicallyactivecompoundsintheAnoectochilusandGoodyeraspecies,JournalofNaturalMedicines,62(2008),132-148.[11]T.Yu,Y.J.Lee,H.J.Jang,A.R.Kim,S.Hong,T.W.Kim,etal.,Anti-inflammatoryactivityofSorbuscommixtawaterextractanditsmolecularinhibitorymechanism,JournalofEthnopharmacology,134(2011),493-500.[12]Y.Zou,G.Hu,Z.Yu,Q.Gu,X.Chen,M.Ning,ApplicationofHEC-HMSmodelformountainfloodforecastingintheWushuibasin,ScienceofSoilandWaterConservation,16(2018),95-102.[13]A.García-Lafuente,E.Guillamón,A.Villares,M.A.Rostagno,J.A.Martínez,Flavonoidsasanti-inflammatoryagents:Im