PCR技术及其应用课件

PCR技術及其應用一PCR技術原理（一）PCR技術簡史（二）PCR的基本原理（三）PCR反應（四）PCR反應體系（五）PCR引物的設計一般原則（六）PCR中應注意的事項（一）PCR技術簡史DNA的複製聚合酶鏈反應的發明1971年，Khorana提出：經過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，並不斷重複該過程便可克隆tRNA基因。但由於測序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術的發明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設想被人們遺忘了……（一）PCR技術簡史DNA的複製聚合酶鏈反應的發明1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發明了聚合酶鏈反應（PCR）基本原理是在試管中模擬細胞內的DNA複製最初採用E-coliDNA聚合酶進行PCR，由於該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯耐熱DNA聚合酶的應用使得PCR能高效率的進行，隨後PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱迴圈儀1993年，Mullis等因此項技術獲諾貝爾化學獎（一）PCR技術簡史DNA的複製聚合酶鏈反應的發明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長（一）PCR技術簡史DNA的複製聚合酶鏈反應的發明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物（一）PCR技術簡史DNA的複製聚合酶鏈反應的發明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美國《Science》雜誌列PCR為十餘項重大科學發明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學獎。引物引物Mullis的構思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段Taq

DNA聚合酶（thermus

aquaticus)酶活性(%)溫度(℃)4050607080901001008060402072℃94℃55℃PCR迴圈（二）PCR的基本原理類似於DNA的體內複製。首先待擴增DNA範本加熱變性解鏈，隨之將反應混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-複性-延伸的過程就是一個PCR迴圈，PCR就是在合適條件下的這種迴圈的不斷重複。DenaturationTemplateDNAbyHeat(95oC)TargetSequenceTargetSequence①範本DNA的變性：範本DNA經加熱至93℃左右一定時間後，使範本DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；PCRCycle-Step1–PCRCycle-Step2–

Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②範本DNA與引物的退火(複性)：範本DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與範本DNA單鏈的互補序列配對結合；PCRCycle-Step3-

At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA範本--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為範本，按堿基配對與半保留複製原理，合成一條新的與範本DNA鏈。Endofthe1stPCRCycle–

ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一個迴圈需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon（三）PCR反應PCR反應條件PCR過程PCR的特點標準的PCR反應試劑：10X緩衝液10μL4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol範本DNA

0.1～2μgTaqDNA聚合酶2.5UMg2+

1.5mmol/LPCR儀（三）PCR反應PCR反應條件PCR過程PCR的特點（三）PCR反應PCR反應的步驟：1.變性

94℃

30-90s

預變時間稍長，使範本充分變質提高溫度會縮短所需時間，但過高溫度或過長時間會破壞酶和dNTP2.複性

40-65℃

30-90s百性結束後，令DNA快速冷卻，以原範本和引物轉錄複製。再進行退火步驟。複性所需溫度決定引物在範本上退火的幾率和特異性。（三）PCR反應3.延伸

70-75℃30s-8min

酶的最適反應溫度在70-75℃之間，延伸溫度一般選在72℃，延伸時間長短由擴增產物的長度決定。4.迴圈次數

25-35之間1234522557294時間（min）溫度（℃）（三）PCR反應PCR反應條件PCR過程PCR的特點適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重複1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物複性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍範本DNA95℃PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第1輪結束第2輪開始PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結束PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點重複30輪後230=1,073,741,824範本DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增理想拷貝數=2nn迴圈次數實際拷貝數=(1+x)nX平均效率,約為0.85n迴圈次數

（三）PCR反應PCR反應條件PCR過程PCR的特點靈敏度高皮克(pg=10-12)量級擴增到微克(ug=10-6)水準能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞病毒檢測的靈敏度可達3個RFU細菌檢測的最小檢出率為3個細菌簡便、快速一次性加好反應液，2～4小時完成擴增擴增產物一般用電泳分析對標本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛髮、細胞、活組織等組織的粗提DNA1.PCR反應成分（1）範本單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結合蛋白類。一般100ngDNA範本/100L。範本濃度過高會導致反應的非特異性增加。（四）PCR反應體系（2）引物濃度

0.1-0.5mol/L

濃度過高易導致範本與引物錯配,反應特異性下降。（3）Taq

DNA聚合酶（thermus

aquaticus)0.5-2.5U/50l

酶量增加使反應特異性下降;酶量過少影響反應產量。（4）dNTP

dNTP濃度取決於擴增片段的長度四種dNTP濃度應相等濃度過高易產生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應產量

dNTP可與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。（5）

Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的啟動劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應體系。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產量下降；Mg2+過高影響反應特異性。Mg2+可與負離子結合，所以反應體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應中游離的Mg2+濃度。2.迴圈參數(1)

變性使雙鏈DNA解鏈為單鏈

95oC20-30秒(2)

退火溫度由引物長度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與範本的非特異性結合;降低溫度可增加反應的靈敏性。（3）延伸

70-75oC，延伸時間由擴增片段長度決定（4）迴圈次數主要取決於模版DNA的濃度一般為25-35次次數過多：擴增效率降低錯誤摻入率增加（五）PCR引物的設計一般原則1.引物長度一般以18～30bp為宜，過短則降低特異性，過長則會引起引物間的退火而影響有效擴增，同時也增加引物合成的成本。2.避免引物內部出現二級結構，避免序列內有較長的回文結構，使引物自身不能形成髮夾結構。3.G/C和A/T堿基均勻分佈，G+C含量在40～60%之間，引物堿基序列盡可能選擇堿基隨機分佈，避免出現嘌呤或嘧啶連續排列。4.要避免兩個引物間特別是3`末端堿基序列互補以及同一引物自身3`末端堿基序列互補的，使它們不能形成引物二聚體或髮卡結構。5.引物3`末端堿基一般應與範本DNA嚴格配對，並且3`末端為G、C或T時引發效率較高。6.引物5`末端堿基可不與範本DNA匹配，可添加與範本無關的序列(如限制性核酸內切酶的識別序列、ATG起始密碼子或啟動子序列等)，便於克隆和表達，但其保護堿基有一定的要求。7.引物的堿基順序不能與非擴增區有同源性。（六）PCR中應注意的事項1.防止污染試劑小量分裝吸頭及EP管一次性使用器皿及工作區域要分開，無菌操作2.設立對照：陽性對照：陽性範本陰性對照：陰性範本試劑對照：除範本外的所有組分二PCR技術應用（一）PCR技術的主要類型（二）PCR技術的應用（一）PCR技術的主要類型1.反向PCR

6.錨定PCR2.不對稱PCR7.原位PCR3.RT-PCR

8.重組PCR4.差異顯示PCR

9.免疫PCR5.即時定量PCR

10.多重PCR1.反向PCR(reversePCR)

是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段對某個已知DNA片段兩側的未知序列進行擴增。可對未知序列擴增後進行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用於僅知部分序列的全長cDNA的克隆,擴增基因文庫的插入DNA；建立基因組步移文庫。已知序列未知序列未知序列已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶2.不對稱PCR

目的：擴增產生特異長度的單鏈DNA。

方法：採用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,關鍵是限制性引物的絕對量。用途：製備核酸序列測定的範本製備雜交探針基因組DNA結構功能的研究

高濃度引物低濃度引物3.RT－PCR:是以反轉錄的cDNA作範本所進行的PCR反應,用於測定基因表達的強度和鑒定已轉錄序列是否發生突變,呈現mRNA多態性,克隆mRNA的5’和3’末端序列,以及從非常少量的mRNA樣品構建大容量的cDNA文庫。逆轉錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴增基因mRNA蛋白質多肽鏈4.多重PCR：在一個反應體系中使用一對以上引物的PCR稱為多重PCR。其結果是產生多個PCR產物，用於檢測特定基因序列的存在或缺失。電泳引物5.即時定量PCR技術即時定量PCR（也稱TaqManPCR,以下簡稱FQ-PCR）是美國PE（PerkinElmer）公司1995年研製出來的一種新的核酸定量技術，該技術是在常規PCR基礎上加入螢光標記探針來實現其定量功能的，與變通PCR相比，FQ-PCR具有許多優點。即時定量PCR(real-timePCR):通過特定設計的PCR儀器來即時檢測PCR擴增過程每一輪迴圈產物的累積數量，可以很好的推算範本的起始濃度，這種工作方式稱為即時定量PCR。（1）原理和方法:

FQ-PCR的工作原理是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反應系統中加入一個螢光標記探針。該探針可與引物包含序列內的DNA範本發生特異性雜交，探針的5’端標以螢光發射基因FAM（螢光發射峰值在518nm處），靠近3’端標以螢光淬滅基團TAMRA（螢光發射峰值在582nm處），探針的3’端被磷酸化以防止探針在PCR擴增過程中被延伸。當探針保持完整時，淬滅基團抑制發射基團的螢光發射。發射基團一旦與淬滅基團發生分離，抑制作用被解除，518nm處的光密度增加而被螢光探測系統檢測到。複性期探針與範本DNA發生雜交，延伸期Taq酶隨引物延伸沿DNA範本移動，當移動到探針切斷,淬滅作用被解除，螢光信號釋放出來.範本每複製一次，就有一個探針被切斷，伴隨一個螢光信號的釋放。由於被釋放的螢光基團數目和PCR產物數量是一對一的關係,因此用該技術可對範本進行準確定量。即時螢光定量PCR:即時定量PCR在檢測過程中通過檢測標記的螢光信號的累積來即時監測整個PCR進程，最後通過標準曲線對未知範本進行定量分析，故稱為即時螢光定量PCR。

即時PCR技術原理

（2）實驗儀器：

實驗儀器一般使用PE公司研製的ABI7100型PCR擴增儀，也可用其他PCR儀。如果用ABI7700型反應型反應系統進行實驗，反應結束後,通過電腦分析,可直接給出定量結果。如果用其他PCR儀,則需要同時使用螢光探測儀測量反應管中的螢光信號,計算出RQ+、RQ-、△RQ。RQ+代表樣品管螢光發射基團發光強度與淬滅基團發光強度的比率,RQ-代表空白管中二者的比率,△RQ（△RQ=RQ+-RQ-）代表PCR過程中螢光信號變化量，經過數據處理，即可得出定量結果。（3）探針：

由於螢光探針的引入，顯著提高了實驗的特異性。探針設計一般應符合以下條件：①探針長度應在20～40個堿基左右，保證結合特異性。②GC堿基含量在40%～60%，避免單核苷酸序列的重複。③避免與引物發生雜交或重疊。④探針與範本結合穩定程度要大於引物與範本結合的穩定程度，因此探針的Tm值要比引物的Tm值至少高出5℃。另外，探針的濃度、探針與範本序列的同源性，探針與引物的距離都對實驗結果有影響。

特點

FQ-PCR不僅具有普通PCR的高靈敏性，而且由於螢光探針的應用，可以通過光電傳導系統直接探測PCR擴增過程中螢光信號的變化以獲得定量結果，所以還具有DNA雜交的高特異性和光譜技術的高精確性，克服了常規PCR的許多缺點。FQ-PCR只須在加樣時打開一次蓋子，其後的過程完全是閉管操作，不需要PCR後處理，避免了常規PCR操作中的諸多弊端。二、PCR技術的應用研究基因克隆，DNA測序，分析突變診斷細菌、病毒、寄生蟲檢測，診斷人類基因組工程遺傳圖譜的構建，DNA測序，表達圖譜法醫犯罪現場標本分析腫瘤各種腫瘤檢測其他……

(一)病原體測定由於PCR技術的問世，使得病原體檢測能夠快速而方便的進行。但由於其高靈敏性，實驗操作很容易受到污染而出現假陽性。只要有微量病原體存在，PCR擴增即可為陽性結果，但並不能作為診斷依據，只有當一定數量的病原體存在時才有臨床意義，因此結範本定量顯得特別重要。常規PCR由於不能定量而限制了其應用，然而，PE公司研製的FQ-PCR技術給解決這一問題提供了可能。目前該技術已經應用於丙肝病毒、人類乳頭瘤病毒、結核桿菌和食品中大腸桿菌等許多病原體的檢測研究。

Morris等用FQ-PCR對黑猩猩丙型肝炎動物模型和臨床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒（HCV）進行了研究。FQ-PCR技術在保持巢式PCR高度敏感性的同時又能提高效率，因此可作為一種檢測HCV的有效方法。同時，由於FQ-PCR可以測出血清中病原體濃度，故可給藥物治療及療效觀察提供參考依據。

以前常規檢測大腸桿菌的方法，都因為繁瑣，需要大量的PCR後處理過程及不能對標本定量而受到限制。美國Witham等1996年將FQ-PCR技術應用於牛肉中大腸桿菌志賀氏毒素基因的檢測研究。針對不同血清變異型的大腸桿菌，他們設計應用不同的探針，從而提高了實驗特異性。他們同時還對探針相對於引物的位置、反應液中探針濃度、鎂離子濃度等影響實驗的因素進行了優化實驗，以提高實驗的準確性和精確性。由於TaqMan系統可以一次測量96管樣品，還可對範本進行準確定量，又不需要進行電泳及EB染色後處理過程，實際應用方便，從而提高了實驗的參考價值和應用價值。因此該實驗方法是食品檢測方面的一個突破。

（二）腫瘤研究

義大利Gelmini等用FQ-PCR技術檢測乳腺癌標本c-erbB-2基因拷貝數目變異情況。他們以β-肌動蛋白基因為參照探索最佳實驗條件，當擴增迴圈數在28～31之間時，△RQ與範本DNA有著較好的劑量依賴關係。他們在此條件下擴增了c-erbB-2基因和β-球蛋白基因，發現△RQ都與各自的範本DNA濃度存在著線性關係，雖然二者斜率不同，但是各個實驗濃度下二者的△RQ之比卻是恒定的。說明儘管二者發光效率不同，卻不影響定量效果。他們將實驗數據與Southern印跡結果和已報告的競爭性PCR結果比較都顯示高度相關性（n=25，r=0.94，P〈0.01）。

（三）

基因表達研究

由於TaqMan系統及螢光探針的應用，對mRNA的檢測顯得較以前常用的方法如Northern印跡、RT-PCR定量法要方便、快速、準確得多。為了探測骨髓基質血小板生成因數（TPO）在巨核細胞生成過程中的作用以及血小板生成因數在特發性血小板減少性紫瘢（ITP）、再生障礙性貧血（AA）和特發性血小板多症（ET）等疾病過程中的病理生理意義，日本Hirayama等用TaqManEZRT-PCR試劑盒在ABI7700反應系統測定了正常人和ITP、AA、ET病人的骨髓基質細胞TPOmRNA水準，又用ELISA方法測定了骨髓和末梢血的TPO濃度。結果顯示ITP和AA病人TPOmRNA水準明顯升高，而ET病人的TPOmRNA水準則正常，經類固醇治療後ITP病人TPOmRNA水準下降；骨髓TPO的濃度與其mRNA水準有相關性；在正常人和ITP病人，TPOmRNA表達水準與巨核細胞計數也有相關性。這個實驗對闡明TPO的作用提供了依據。

（四）免疫組份分析

對免疫T細胞群體V-β組份進行分析是研究健康和疾病免疫應答反應的重要手段，可通過流式細胞法或RFQ-PCR法來進行。1997年Lang等用FQ-PCR技術進行實驗，他們在反應系統中引入螢光探針，將下游引物與探針固定，然後，針對不同的V-β成份，選用特異的上游引物進行擴增，再對反應中產生的螢光信號進行處理，即可獲得各個成份的數據。

（五）基因突變及多態性的研究

美國Ibrahim等1997年用FQ-PCR技術對正常痘病毒多態性進行了研究。他們採用一對可與正常痘病毒血凝素基因的某一DNA片段結合的引物，並設計兩個有單核苷酸差異的寡核苷酸探針，用螢光標記後進行實驗，順利地把有此單核苷酸差異的兩個痘病毒株進行鑒定。該技術也可用於猴痘和病毒DNA疫苗的單核苷酸變異多態的研究。

（六）其他方面

日本Isono利用FQ-PCR進行葉綠體成熟度與其基因組拷貝數關係的研究。他們以核基因Cab作為內參照，進行葉綠體基因rbc1拷貝數測定，結果發現子葉出現以後，葉綠體基因拷貝數顯著增加，進而把葉綠體的基因拷貝數增加與光誘導的葉綠體成熟過程聯繫起來。1998年美國Higgins等還建立起一套用螢光探針檢測鼠疫纖溶酶原啟動基因（pla）的實驗方法。綜上所述，FQ-PCR作為一種核酸定量技術，應用較多且較成熟的主要是在病原體檢測方面，其優越性在此方面也得以充分體現。因此將該項技術進一步開發應用於臨床，具有很大潛力。但是在遺傳病和腫瘤研究方面，尤其是基因表達的研究，該技術目前應用的還較少，在此方面加強研究應用，將會有廣闊的前景。

本章重點掌握的內容掌握RT-PCR、反向PCR、多重PCR、即時螢光定量PCR的概念。PCR的基本原理PCR引物設計的一般原則1、要求將下麵基因片段克隆至表達載體pET-28相應位點上，並獲得此基因的表達。

ATGGGTCGGGATCCTGATACAGATAATAATTTCTCAAAGGACCATGGTTGGTATTTAGCTTATTCTATACCTGACACAGGGGAATCACAAATAAGAAAATTTTCAGCATTAGCTAGATATGAATGGCAAAGAGGAAACTATAAACAAGCTACATTCTATCTTGGAGAGGCTATGCACTATTTTGGAGATATAGATACTCCATATCATCAAGCTTATGTTACTGCCGTTGATAGCGCAGGACATGTTAAGTTTGAGACTTTTGCAGAGGAAAGAAAAGAACAGTATAAAATAA