DB37T-苹果轮纹病菌快速检测方法

ICSFORMTEXT65.020.20FORMTEXTB16FORMTEXTDBFORMTEXT37DBFORMTEXT37/TFORMTEXTXXXXX—FORMTEXTXXXXFORMTEXTFORMTEXT苹果轮纹病菌快速检测方法FORMTEXTRapiddetectionofbotryosphaeriadothideaFORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX发布FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX实施FORMTEXT山东省市场监督管理局发布DB37/XXXXX—XXXX前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省烟台市农业科学研究院。本标准主要起草人：王英姿、刘保友、汪少丽、王培松、石洁。苹果轮纹病菌快速检测方法范围本标准规定了用环介导等温扩增（LAMP）快速检测苹果轮纹病菌的测定方法。本标准适用于苹果叶片、枝条和果实中苹果轮纹病菌的快速检测。方法检出限：10-7ng/μL苹果轮纹病菌DNA。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测原理扩增原理根据苹果轮纹病菌的ITS序列中特异性序列设计特异性内、外引物及环引物各一对，特异性序列参见附录A。三对引物特异性识别靶标序列上的六个独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在ITS基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物，加入显色液即可通过颜色变化观察判定结果。显色液显色原理SYBRGreenI是一种高灵敏度的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的800～1 000倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色；当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。缩略语下列缩略语适用于本文件。LAMP：环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）ITS：内转录间隔区（Internaltranscribedspacer）2×LampMasterMix：等温扩增PCR混合液Bst酶：BstDNA聚合酶（BstDNApolymerase）试剂和材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水为GB/T6682中规定的一级水。等温扩增PCR混合液（2×LampPCRMasterMix由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。)）：包含40 mmol/LTris-HCl、20 mmol/L(NH4)2SO4、20 mmol/LKC1（pH值为8.8）、16 mmol/LMgSO4、2.0 mmol/LdNTPs、0.2 %TrionX-100。由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。BstDNA聚合酶：酶浓度8 U/μL。显色液：SYBRGreenI荧光染料，1 000×。引物：根据苹果轮纹病菌ITS基因序列设计一套特异性引物，包括外引物1（F3），外引物2（B3），内引物1（FIP），内引物2（BIP），环引物1（LF）和环引物2（LB）。外引物扩增片段长度：189 bp，引物序列见附录A。DNA快速提取液：DNA-EZReagentsAll-DNA-Fast-Out由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。)。由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。甜菜碱：5 mol/L。离心管：0.1 mL、1.5 mL。塑料研磨棒：长度70 mm，研磨头外径6.2 mm，研磨头长度9.5 mm。仪器设备恒温箱：满足65 ℃±3 ℃、80 ℃±1 ℃要求。移液器：量程0.5 μL～10 μL，量程10 μL～100 μL，量程100 μL～1 000 μL。测定步骤试验设置阴性对照：采用不含有目标基因序列的苹果腐烂病菌（Valsamali）基因组DNA为模板。阳性对照：采用含有目标基因序列的苹果轮纹病菌（Botryosphaeriadothidea）基因组DNA为模板，浓度应略高于方法检出限。空白对照：以水代替DNA模板。试样采集进行田间轮纹病菌快速检测时，切取约0.5 cm×0.5 cm待检测的苹果组织（果实、叶片、枝条），放置于1.5mL离心管中保存并标记。试样DNA提取将100 μLDNA快速提取液加入到盛有试样的1.5 mL离心管中，用研磨棒研磨5 min。80 ℃±1 ℃加热5 min，如果是难以破裂的细胞和材料，则保温时间可以延长到10 min～30 min。用手振荡混匀后取裂解物直接进行LAMP反应。LAMP反应步骤反应体系LAMP反应体系见表1。每个试样各做2个平行管。加样时应使试样DNA溶液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将1 μL显色液滴于反应管的管盖内侧，盖管盖时应尽量小心，防止显色液混合进入反应液中。这样试样扩增反应后不必开盖即可观察颜色变化。LAMP反应体系组分工作液浓度加样量反应体系最终浓度外引物1（F3）10 μmol/L0.5 μL0.2 μmol/L外引物2（B3）10 μmol/L0.5 μL0.2 μmol/L内引物1（FIP）10 μmol/L2 μL0.8 μmol/L内引物2（BIP）10 μmol/L2 μL0.8 μmol/L环引物1（LF）10 μmol/L1 μL0.4 μmol/L环引物2（LB）10 μmol/L1 μL0.4 μmol/LLampPCRMasterMix2×12.5 μL1×BstDNA聚合酶8 U/μL0.5 μL0.16 U/μL甜菜碱5 mol/L4 μL0.8 mmol/LDNA模板-1 μL-水-补足至25.0 μL-反应过程65 ℃±3 ℃恒温扩增60 min，80 ℃±1 ℃持续10 min使酶灭活，反应结束。显色反应反应结束后，将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀，立即在正常光照条件下于黑色背景（如黑布、黑色纸板）下进行颜色观察。阴性对照：反应管中液体呈橙色。阳性对照：反应管中液体呈绿色。空白对照：反应管中液体呈橙色。防污染措施环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T27403中附录D规定。结果判定待测样品2个平行样反应管中液体均呈橙色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结果为阴性，不携带苹果轮纹病菌。待测样品2个平行样反应管中液体至少一管呈绿色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结果为阳性，携带苹果轮纹病菌。若与上述条件不符，则本次检查结果无效，应更换试剂按本方法重新检测。

（资料性附录）

苹果轮纹病菌ITS基因特异性序列苹果轮纹病菌ITS基因特异性序列（accessionno.MN559436.1）1ATTGCGCCCTTTGGTATTCCGAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACAACCCTCAAGC61TCTGCTTGGTATTGGGCACCGTCCTTTGCGGGCGCGCCTCAAAGACCTCGGCGGTGGCGT121CTTGCCTCAAGCGTAGTAGAACATACATCTCGCTTCGGAGCGCAGGGCGTCGCCCGCCGG181ACGAACCTTCTGAACTTTTCTCAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAAC下划线所示部分为引物扩增匹配区段。组成引物中碱基构成外引物1（F3，5’-3’）：TGCCTGTTCGAGCGTCAT外引物2（B3，5’-3’）：TCCGAGGTCAACCTTGAGAAF1cF2内引物1（FIP，5’-3’）：CACCGCCGAGGTCTTTGAGGTACAACC