分子体外诊断检查 静脉全血中循环肿瘤细胞的预检查方法规范 第1部分分离的RNA标准立项发展报告

分子体外诊断检查静脉全血中循环肿瘤细胞的预检查方法规范第1部分:分离的RNA标准立项发展报告EnglishTitle:StandardizationDevelopmentReport:Molecularinvitrodiagnosticexaminations—Specificationsforpre-examinationprocessesforcirculatingtumourcells(CTCs)invenouswholeblood—Part1:IsolatedRNA摘要本报告旨在对国际标准ISO/TS7552-1:2024《分子体外诊断检查静脉全血中循环肿瘤细胞的预检查方法规范第1部分:分离的RNA》的立项背景、核心内容、行业影响及未来发展进行系统性阐述。随着液体活检技术在肿瘤精准医疗领域的快速普及，循环肿瘤细胞（CTCs）的分析在癌症早期筛查、疗效监测及预后评估中扮演着日益关键的角色。然而，由于CTCs在血液中含量极低且高度异质，其预检查过程（包括样本采集、运输、富集、RNA提取及保存）的标准化缺失，长期以来是导致不同实验室间检测结果不可比、假阳性/假阴性率高的主要技术瓶颈。该标准作为ISO7552系列的首个部分，旨在为基于CTCs分离RNA的分子诊断提供统一的技术规范，明确从静脉全血样本采集到RNA质检的全流程操作要求、质量控制指标及干扰因素管理。报告详细解读了标准中关于样本质量验证、RNA完整性评估、关键设备校准及性能验证的核心要求。通过分析标准发布背景、对比国内外现状，本报告强调了该标准的实施对于提升液体活检实验室的检测一致性、推动肿瘤精准诊疗规范化、促进国际间检验结果互认具有不可替代的基础性作用。结论部分展望了该标准在未来与人工智能辅助分析、多组学联用及标准化室间质评体系的融合发展前景。关键词中文：分子体外诊断；循环肿瘤细胞；预检查过程；RNA分离；液体活检；国际标准；样本质量；标准化英文：Molecularinvitrodiagnostics(IVD);Circulatingtumorcells(CTCs);Pre-examinationprocesses;RNAisolation;Liquidbiopsy;Internationalstandard(ISO);Samplequality;Standardization正文1.引言与背景液体活检技术正以前所未有的速度改变着肿瘤学的临床实践。其中，循环肿瘤细胞（CTCs）作为从原发或转移肿瘤灶脱落进入外周血的完整活细胞，携带了关于肿瘤基因变异、转录谱、药物敏感性及耐药机制的全面信息。与循环游离DNA（cfDNA）相比，CTCs的RNA分析能够反映肿瘤细胞动态的基因表达状态，在识别上皮-间充质转化（EMT）、探索治疗靶点及监测微小残留病灶（MRD）方面展现出独特价值。然而，将CTCs的RNA分析应用于临床诊断面临着严峻的挑战。首先，CTCs在外周血中的数量极其稀少（通常每毫升血液中仅有几个到几十个），被大量的血细胞所淹没。其次，RNA分子本身化学性质不稳定，极易被血液中富含的RNA酶降解。更重要的是，整个“预检查流程”——即样本从患者体内取出到被实验室正式分析之前的这一过程——存在巨大的变异性。不同的采血管抗凝剂、不同的保存温度、不同的CTCs富集方法、以及不同的RNA提取试剂盒，均会对最终检测结果的准确性和重复性产生决定性影响。在ISO7552-1:2024发布之前，全球范围内缺乏针对CTCsRNA预检查过程的高层级、普适性技术规范。现有的指南多聚焦于CTCs的计数或免疫荧光染色，而关于其核酸，尤其是RNA的提取和质量控制，业界标准不一，导致不同临床研究甚至同一实验室不同批次间的结果难以整合和解释。鉴于此，国际标准化组织（ISO）通过其下设的医学实验室检验和体外诊断系统技术委员会（ISO/TC212）启动了该标准的制定工作，旨在建立一套严谨、可操作的规范体系，填补行业空白。2.标准核心内容解析ISO/TS7552-1:2024作为一份技术规范（TechnicalSpecification），并非刚性的管理标准，而是提供了目前国际上公认的最佳操作实践框架。标准全文结构严谨，主要涵盖以下几个核心领域：2.1范围与术语定义标准明确界定了其适用范围：适用于进行分子体外诊断检查的实验室，在静脉全血中分离CTCs并提取其RNA进行后续分析（如qPCR、RNA-seq等）的前期过程。标准不涉及后续的具体检测分析方法本身。标准对“循环肿瘤细胞”、“预检查过程”、“分离的RNA”、“血液样本稳定性”、“RNA完整性”等关键术语进行了精准定义，为后续技术细节的阐述奠定了语言基础。2.2血液样本的采集、运输与贮存这是控制质量的第一道也是最关键的门槛。标准详细规定：*采血管选择：推荐使用含有稳定剂的专用CTCs采血管（如CellSearch®或类似的EDTA+防腐剂管），以抑制白细胞变性、稳定CTCs并防止RNA降解。普通EDTA管仅在短时间内（如2小时内）可行，且需严格冰浴保存。氟化钠/草酸钾管因其对细胞代谢的抑制作用而被明确推荐。*采集流程：强调避免溶血，避免第一管血液（因其可能含有穿刺损伤的组织碎片）用于CTCs分析，应采用无针或小孔径（如21G）采血，避免剧烈震荡。*运输与贮存条件：标准规范了温度和时间窗口。例如，若使用标准EDTA管，必须在2小时内完成CTCs富集或在4℃下短暂保存；若使用稳定性管，在室温下的最长保存时间可达72-96小时，但需提供验证数据。标准要求实验室必须建立一套记录系统，追踪每份样本的“离体-制备”时间。2.3CTCs的富集与纯化由于RNA分析要求尽量去除白细胞等干扰细胞，标准对富集过程作出了技术性要求：*富集方法：无论是基于物理特性的微流控、膜过滤，还是基于免疫学的磁珠分选（阳性分选如EpCAM，阴性分选如CD45），标准均要求提供关于该方法对目标CTCs捕获效率及白细胞去除效率的验证数据。*RNA酶控制：在整个富集及裂解过程中，必须使用无RNA酶的水、耗材和试剂。标准建议在裂解缓冲液中添加RNA酶抑制剂，并严格控制操作环境。2.4RNA的分离、纯化与保存标准对RNA提取步骤进行了详细规范，强调质量优先于数量：*提取方法：推荐使用基于硅胶膜离心柱的提取法或磁珠法，并配合柱上DNA酶消化步骤（DNasedigestion），确保去除基因组DNA污染。*质量控制（QC）：标准首次对分离的RNA提出了明确的QC要求。必须测量RNA浓度，并使用如RIN值（RNAIntegrityNumber）或DV200值（片段长于200nt的RNA比例）来评估完整性。对于低丰度CTCs样本，即使总RNA量极低，也应进行微流控电泳或RT-qPCR内参基因扩增检测来确认是否存在有效RNA。*保存：提取后的RNA应储存于-80℃或液氮中，避免反复冻融。2.5性能验证与比对为推动标准化落地，标准要求实验室在引入任何新的设备或试剂耗材时，必须进行规范化的性能验证，包括重复性、再现性、线性范围及最低检测限（对于CTCs而言，通常是1-10个细胞）。此外，实验室需常规参与室间质量评价计划或与参考方法进行比对验证。3.主要参与单位介绍ISO/TS7552-1:2024的制定是一项凝聚全球顶尖专家智慧的工作。其中，德国保罗·埃尔利希研究所（Paul-Ehrlich-Institut,PEI）作为标准的主要贡献者和技术核心团队之一，发挥了不可替代的引领作用。保罗·埃尔利希研究所是德国联邦卫生部下属的独立机构，同时也是世界卫生组织（WHO）指定的协作中心。该研究所主要负责生物医药产品，包括血液制品、疫苗和体外诊断试剂的监管、评估与标准化研究。在液体活检领域，PEI不仅是德国临床诊断标准化的旗帜，更是国际标准化组织ISO/TC212与欧洲标准化委员会（CEN）之间的重要桥梁。在此标准的起草过程中，PEI的分子诊断与肿瘤生物学研究组承担了多项验证性研究任务。该研究组长期致力于CTCs的检测和采血管稳定性研究，其团队开发了一种利用多种标志物（如EpCAM,CK,CD45及间充质标志物）进行多参数流式细胞术分析的方法，用于评估采血管在不同保存条件下对CTCs数量的保持效果及RNA质量的影响。他们提供的实验数据成为支撑标准中关于“采血管性能验证”、“稳定时间窗口”及“RNA完整性阈值设定”等技术参数的实证基础。此外，PEI还利用其作为监管机构的权威性，在标准制定过程中协调各方利益，平衡了商业试剂厂家、学术临床研究机构以及医疗监管部门的诉求，确保了标准既具有前瞻性，又具备实际可操作性。4.标准的影响与实施该标准的发布对于推动液体活检领域的跨越式发展具有重要意义：4.1提升跨研究/跨实验室的可比性过去，即便使用相同的检测试剂盒，由于预检查环节的差异，不同医院的结果难以直接比较。ISO7552-1的出台，为CTCsRNA检测提供了通用的“前置协议”，使得临床研究数据能够进行荟萃分析，加速了新型肿瘤标志物的发现和验证。4.2支撑临床实践规范化对于有意开展CTCsRNA检测的临床实验室，该标准是一本“操作手册”。它帮助实验室规避因样本处理不当造成的诊断误差，尤其是在“液体活检”用于治疗靶点监测（如检测EGFR、AR-V7等剪接变体）时，RNA的质量直接决定检测结果的可靠性。4.3推动上游产业链升级该标准对采血管、保存液、RNA提取试剂盒的性能要求提出了明确指标。这将激励体外诊断企业（如德国凯杰Qiagen、美国Bio-Rad等）开发更高效、更稳定的配套产品，促进行业良性竞争和产品质量提升。5.结论ISO/TS7552-1:2024《分子体外诊断检查静脉全血中循环肿瘤细胞的预检查方法规范第1部分:分离的RNA》的发布，标志着循环肿瘤细胞分子诊断从“自由探索”阶段正式迈入“标准规范”的新纪元。该标准以严谨的科学态度，系统规范了从采血到RNA质检的全链条关键控制点，有效解决了因预分析因素导致的结果失真问题。它不仅是实验室质量管理的工具书，更是推动液体活检技术从科研工具向临床诊断产品转化的关键法规技术支撑。展望未来，标准的实施将与以下领域深度融合：第一，随着新一代测序（NGS）技术对低起始量RNA的精细分析能力提升，该标准中关于RNA质量控制的条款将成