CN115216443B 体外快速高效分化获得人多能干细胞来源的nk细胞的方法及应用 （中国科学院广州生物医药与健康研究院）

multipotenthematopoieticstem/progenitmultipotenthematopoieticstem/progenit体外快速高效分化获得人多能干细胞来源本发明涉及一种体外快速高效分化获得人多能干细胞来源的自然杀伤细胞(NK细胞)的培养基及其用途和制备NK细胞的方法。培养基包在促进人多能干细胞来源的造血干/祖细胞分化上述培养基培养人多能干细胞来源造血干/祖细造血干/祖细胞分化成NK细胞，具有培养周期短2所述双抗为青霉素和链霉素，所述双抗是以溶液的形式提供的，所述双所述维生素C在所述培养基中的终浓度为40-60m所述IGF-1在所述培养基中的终浓度为40-60m所述IL2在所述培养基中的终浓度为40-60n所述IL7在所述培养基中的终浓度为40-60n所述IL15在所述培养基中的终浓度为40-60n所述SCF在所述培养基中的终浓度为40-60n所述Flt3-L在所述培养基中的终浓度为40-60n所述血清在所述培养基中的终浓度为15-所述谷氨酰胺在所述培养基中的终浓度为0.5-1所述双抗为青霉素和链霉素，所述双抗是以溶液的形式提供的，所述双所述维生素C在所述培养基中的终浓度为40-60m所述IGF-1在所述培养基中的终浓度为40-60m所述IL2在所述培养基中的终浓度为40-60n所述IL7在所述培养基中的终浓度为40-60n所述IL15在所述培养基中的终浓度为40-60n所述SCF在所述培养基中的终浓度为40-60n所述Flt3-L在所述培养基中的终浓度为40-60n所述血清在所述培养基中的终浓度为15-所述谷氨酰胺在所述培养基中的终浓度为0.5-15.根据权利要求2所述的方法，其特征在于6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述造3将所述多能干细胞在所述第一分化培养基中进行第一将所述第一培养处理的产物在所述第二分化培养基中进行第二将所述第二培养处理的产物在所述第三分化培养基中进行第三将所述第三培养处理的产物在所述第四分化培养基中进行第四培养22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述A-432.根据权利要求29所述的方法，其特征在36.根据权利要求29所述的方法，其特5[0002]免疫细胞疗法在肿瘤治疗中具有重要意义。自然杀伤细胞(NaturekillerT)治疗具有严重的副反应，例如神经毒性和“细胞因子风暴”(cytokinerelease试验尚未报道过继NK细胞治疗产生如移植物抗宿主疾病(graft-versus-hostdisease，比T细胞的应用范围更为广泛。目前临床试验采用从健康人外周血单个核细胞分离并扩增[0006]本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技本发明提供了一种培养基及其用途和制备NK细胞的方法，本发明的培养能够使造血干/祖6[0011]在本发明的另一方面，本发明提出了一种前述培养基在促进造血干/祖细胞分化大量实验得到上述较优培养基，该培养基可促进早期中胚层细胞分化为侧板中胚层细胞[0017]本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得[0022]图5是根据本发明实施例2中获得的NK细胞生成CD45和CD56的情况以及其与外周[0024]图7是根据本发明实施例3中检测K562刺激或PMA刺激后的NK细胞分泌INF-γ的情7[0026]图9是根据本发明实施例4中检测NK细胞在不同效靶比情况下对不同肿瘤细胞的胞-侧板中胚层细胞-生血内皮细胞-造血干祖细胞。具体可以参考文献MappingthePairwiseChoicesLeadingfromPluripotencytoHumanBone,Heart,andOtherMesodermCellTypes.Cell,2016,166,451-8[0046]在一些优选方案中，所述IL2在所述培养基中[0047]在一些优选方案中，所述IL7在所述培养基中[0049]在一些优选方案中，所述SCF在所述培养基中[0051]在一些优选方案中，所述血清在所述培养基中的终浓度为5-25优选为15-9的早期中胚层细胞纯度可高达100％。更重要的是，本发明中通过bFGF和GSK3抑制剂的加[0056]在一些优选方案中，所述BMP信号通路激活剂在所述第一分化培养基中的终浓度[0057]在一些优选方案中，所述ActivinA在所述第一分化培养基中的终浓度为0.1-[0058]在一些优选方案中，所述bFGF在所述第一分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/[0065]在一些优选方案中，所述BMP信号通路激活剂在所述第二分化培养基中的终浓度[0066]在一些优选方案中，所述TGF-β通路抑制剂在所述第二分化培养基中的终浓度为进一步提高早期中胚层细胞分化为侧板中胚层[0067]在一些优选方案中，所述WNT通路抑制剂在所述第二分化培养基中的终浓度为进一步提高早期中胚层细胞分化为侧板中胚层[0074]在一些优选方案中，所述VEGF在所述第四分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/进一步提高生血内皮细胞分化为造血干/祖[0075]在一些优选方案中，所述bFGF在所述第四分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/进一步提高生血内皮细胞分化为造血干/祖[0076]在一些优选方案中，所述TGF-β受体阻断剂在所述第四分化培养基中的终浓度为[0077]在一些优选方案中，所述促血小板生成素在所述第四分化培养基中的终浓度为[0078]在一些优选方案中，所述IL-6在所述第四分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/进一步提高生血内皮细胞分化为造血干/祖[0079]在一些优选方案中，所述IL-3在所述第四分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/进一步提高生血内皮细胞分化为造血干/祖[0085]在本发明的第五方面，本发明提出了一种第一方面所述的培养基在促进造血干/[0095]为了解决上述问题，发明人先诱导hiPSCs分化为CD34+CD43+HSPCs，再取悬浮的[0100]在一些优选方案中，所述VEGF在所述第三分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/进一步提高侧板中胚层细胞分化为生血内皮[0101]在一些优选方案中，所述bFGF在所述第三分化培养基中的终浓度为0.1-100ng/进一步提高侧板中胚层细胞分化为生血内皮述培养时间分化得到的生血内皮细胞的纯度可达7述培养时间分化得到的造血干/祖细胞的纯度可达9[0111]在一些优选方案中，所述造血干/祖细胞是将多能干细胞在多能干细胞分化培养hiPSCs于第一分化培养基(HDM培养基+50ng/mlBMP4+50ng/mlActivinA+50ng/mlbFGF+养基更换为第二分化培养基(HDM培养基+50ng/mlBMP4+5μMA-83-01+5μMIWR-养基更换为第三分化培养基(HDM培养基+50ng/mlVEGF+50ng/mlbFGF)，诱导侧板中胚层基+50ng/mlVEGF+50ng/mlbFGF+50μMSB43154+50ng/ml促血小板生成素(简称TPO)+生HSPCs，第8天可收集大量悬浮的HSPCs。如图3所示，T+早期中胚层细胞分化效率接近100HAND1+侧板中胚层细胞分化效率也接近100CD34+生血内皮细胞分化效率达到[0118]本申请的HDM培养基包括DMEM/F12(Hyclone)、ITS(insulintransferrin-养基+20％FBS+1％GlutaMAXTM-1+1％P/S+50mg/mlascorbicacid+50ng/mlIL-2+50ng/mlIL-7+50ng/mlIL-15+50ng/mlSCF+50ng/mlFlt-3L+50ng/mlIGF-1)中铺好小鼠骨髓[0124]采用细胞流式仪检测实施例2获得的iPS-NK细胞的分泌功能。通过流式细胞仪检[0127]将实施例2获得的iPS-NK细胞与表达荧光素酶基因的不同肿瘤细胞按照不同效靶养基+20％FBS+1％GlutaMAXTM-1+1％P/S+50mg/mlascorbicacid+50ng/mlIL-2+50ng/组与实验组的区别仅在于培养基中不添加IGF-1；