因工程制药课件

基因工程制药

2026/7/281一、限制性核酸内切酶是一类能识别特殊核甘酸序列，并水解DNA分子的磷酸二酯键,从而切断双链DNA的核酸水解酶。主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵作用。2026/7/282（一）限制性内切酶的来源寄主控制的限制（restriction）与修饰(modification)现象：人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。2026/7/284R/M体系：是由两种酶活性配合完成的：一种是修饰的甲基转移酶另一种是核酸内切限制酶2026/7/285E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶※当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。

※EcoB(大肠杆菌B株)的核酸酶不能识别已甲基化的序列。2026/7/286

R/M体系的作用：保护自身的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解TGAN8TGCTACTN8ACGATGAN8TGCTACTN8ACGAECOB核酸酶甲基化酶CH3CH3CH3CH3噬菌体来源序列宿主来源序列2026/7/287※限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。※由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。2026/7/288※1968年，阿尔伯证明了一种特别的限制酶的存在，它只分裂那些含有为噬菌体所特有的某种序列的核苷酸；※

这一工作经过内森斯和史密斯的发展，从流感嗜血杆菌d株中分离出HindII和HindIII。※

限制性核酸酶的发现，为基因结构、DNA碱基顺序分析和基因工程的研究开辟了途径。2026/7/289阿尔伯WernerArber瑞士巴塞尔Biozentrum大学史密斯HamiltonO.Smith美国霍普金斯大学医学院内森斯DanielNathans美国霍普金斯大学医学院为此，W.阿尔伯，H.史密斯和D.内森斯三人共同获得了1978年诺贝尔生理学或医学奖。2026/7/2810（二）限制性内切酶的分类与命名根据酶的功能、大小和反应条件，及切割ＤＮＡ的特点，可以将限制性内切酶分为三类：

Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶2026/7/2811Ⅰ型酶：※1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出的核酸内切酶。如EcoK

和EcoB

※分子量较大，反应需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。RSMR亚基：限制酶M亚基：甲基化酶S亚基：识别DNA序列2026/7/2812Ⅰ类酶虽然能够在一定序列上识别DNA分子,并能同DNA分子作用,因其识别DNA后,要朝一个方向或两个方向移动一段距离(通常为1000个碱基左右)，并且要形成一个环才能切割DNA,所以识别位点和切割位点不一致，产生的片段较大。

2026/7/2813这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大。TGAN8TGCTACTN8ACGAECOB核酸酶1000bp2026/7/2814Ⅱ型酶※1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分离出来的限制酶。※分子量较小（105Da），只有一种多肽，通常以同源二聚体的形式存在。反应只需Mg++的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。许多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重组。2026/7/28152026/7/28162026/7/2817两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片段；

两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。

2026/7/2818粘性末端(stickyends;cohensiveends)，是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构。它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。具平末端的DNA片段则不易于重新环化。限制酶都可以产生两种粘性末端，一种是形成具有3′-OH单链延伸的粘性末端，另一种则是形成具有5′-P单链延伸的粘性末端，

2026/7/28192026/7/28202026/7/28212026/7/28222026/7/28232026/7/2824Ⅲ型酶这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的下游的24~26bp处切开ＤＮＡ，所以它的切割位点也是没有特异性的。Eco57I

CTGAAGNNNNNNNNNNNNNNNN^GACTTCNNNNNNNNNNNNNN^2026/7/2825ⅡⅠⅢ酶分子内切酶与甲基化酶分子不在一起三亚基双功能酶二亚基双功能酶识别位点4-6bp,大多数为回文对称结构二分非对称5-7bp非对称切割位点在识别位点中或靠近识别位点无特异性，至少在识别位点外1000bp在识别位点下游24-26bp各种限制与修饰系统的比较

2026/7/2826限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名原则：

第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的第一个字母。第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母。其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号。罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。例：EcoRI:来自于EscheriacoliRY13的第一个限制酶。2026/7/2827限制性核酸内切酶的命名属名 种名 株名Haemophilus

influenzae

d嗜血流感杆菌d株

HindIIId株中发现的第三个酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶2026/7/2828（三）II型限制性内切酶的基本特征1.基本特征1.识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列2.大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧3.识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5EcoRI的识别序列EcoRI的切割位点2026/7/2829？？II型限制性内切酶的基本特征粘性末端平末端同裂酶同尾酶两条链围绕着一个对称结构中心交错地断裂两条链在一个对称结构的中心上的断裂识别相同靶序列的核酸内切酶产生相同的粘性末端的核酸内切酶2026/7/2830限制性内切酶在DNA克隆中的应用2026/7/2831gacggatcgggagaagcttcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgagctcagaatctggagctcaagctt2026/7/2832第二节基因工程的工具酶一、限制性核酸内切酶二、DNA连接酶

三、DNA聚合酶四、核酸酶五、核酸修饰酶2026/7/28332026/7/2834ＤＮＡ连接酶

能够将DNA链上彼此相邻的3’-羟基（OH）和5’-磷酸基团（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。2026/7/28352026/7/2836连接酶的作用机理连接酶先与ATP作用，以共价键相连生成E-AMP中间体。中间体即与一个DNA片段的5‘-磷酸相连接形成E-AMP-5’-DNA。然后再与另一个DNA片段的3‘-OH末端作用，E和AMP脱下，两个DNA片段以3’,5‘-磷酸二酯键相连接。此反应是由焦磷酸(ppi)的水解作用激发的，需要花费两个高能磷酸键。2026/7/2837DNA的腺苷酸复合物3’-OH对P原子作亲核攻击形成磷酸二酯键连接酶的作用机理此反应是由焦磷酸

(ppi)的水解作用激发的需要花费两个高能磷酸键（赖氨酸残基）2026/7/28382026/7/28391.大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75KD的多肽链。可以封闭双螺旋DNA上具有5‘-磷酰基和3’-羟基的缺口（nick），不能封闭裂口（gap）；因此，只能连接粘性末端的DNA片段，不能拼接DNA平头末端；用于粘性末端DNA或切口间连接。2026/7/28402.Ｔ４ＤＮＡ连接酶（DNAligase）

该酶常从Ｔ４噬菌体的受感细胞中提取，是由Ｔ４噬菌体基因组所编码的，它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来。基因工程中常用的连接酶是Ｔ４连接酶。

DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。2026/7/2841第二节基因工程的工具酶一、限制性核酸内切酶二、DNA连接酶三、DNA聚合酶

四、核酸酶五、核酸修饰酶2026/7/2842三、DNA聚合酶DNA聚合酶 催化dNTP聚合到核酸链上的酶。是DNA复制的主要酶。全称叫依赖DNA的DNA聚合酶（DNA-dependentDNApolymerase）或DNA指导的DNA聚合酶（DNA-directedDNApolymerase），均缩写为DDDP。2026/7/28432026/7/2844常用的DNA聚合酶：

大肠杆菌DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow大片段酶、

T4DNA聚合酶、

T7DNA聚合酶、反转录酶等。2026/7/2845共同点：

把脱氧核糖核苷酸连续的加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。2026/7/2846常用几种DNA聚合酶的特性比较2026/7/2847（一）大肠杆菌DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ（PolI）、

DNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）、

DNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）、

PolI和PolⅡ的主要功能参与DNA的合成；

PolⅢ的功能同DNA的复制有关；

Pol

Ⅰ

同DNA分子克隆的关系最为密切。2026/7/28481.大肠杆菌DNA聚合酶I1957年，美国的生物学家A.Kornberg首次证实，在大肠杆菌提取物中存在一种DNA聚合酶，即现在所说的DNA聚合酶I。由polI基因编码的一种单链多肽蛋白质。

DNA聚合酶I，可以被蛋白酶切割成两个片断:一个具有全部的3’→5’的外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性;另一个具有全部5’→3’的外切酶活性。2026/7/2849DNA聚合酶Ⅰ的酶活性：

5’→3’的聚合酶活性；

5’→3’的外切酶活性；

3’→5’的外切酶活性（较低）。2026/7/2850核酸外切酶活性

3′5′3′→5′外切酶活性5′→3′外切酶活性

3′5′

3′5′5′

3′2026/7/2851（1）5’→3’的聚合酶活性DNA聚合酶Ｉ发挥作用的条件：底物：四种脱氧核苷5’-三磷酸（dNTP）；Mg＋＋离子；带有3’-OH游离基团的引物链；DNA模板：单链，双链（糖-磷酸主键上有一个或多个断裂）。2026/7/2852（2）5’→3’的核酸外切酶活性5’→3’的外切酶活性，所切割的DNA链必须是位于双螺旋的区段上；切割部位可以是末端磷酸二酯键，也可以是在距5’末端数个核苷酸远的一个键上发生；DNA的合成可以增强5’→3’的核酸外切酶活性；5’→3’核酸外切酶的活性位点同聚合作用的活性位点以及3’→5’的水解作用位点是分开的。2026/7/28532026/7/2854（3）3’→5’核酸外切酶活性能催化DNA链发生水解作用，从DNA链3’-OH末端开始向5’的方向水解DNA，并释放出单核苷酸分子。对酶活的影响：反应物中缺乏dNTPs时，大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ的3’→5’核酸外切酶活性，将会发挥作用。但对于底物是双链的DNA，在具有dNTPs时，这种降解活性将会被5’→3’的聚合酶活性所抑制。2026/7/28552026/7/2856DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途：通过DNA缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。

DNA缺口转移（nicktranslation）在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶Ⅰ的5’→3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从缺口的5’一侧移去一个5’核苷酸之后，聚合酶作用就会在缺口的3’一侧补上一个新的核苷酸，但polⅠ不能在3’-OH和5’-P之间形成一个键，随着5’一侧的核苷酸不断移去，3’一侧的核苷酸又按序列增补，缺口便沿着DNA分子合成的方向移动。2026/7/2857切口平移2026/7/28582.Klenow

聚合酶Klenow片段（Klenowfragment）：E.coliDNA聚合酶I经部分水解生成的C末端605个氨基酸残基片段。该片段保留了DNA聚合酶I的5ˊ→3ˊ聚合酶和3ˊ→5ˊ外切酶活性，但失去了5ˊ→3ˊ外切酶活性。

5’→3’聚合酶活性；

5’→3’外切酶活性；

3’→5’外切酶活性。5’→3’聚合酶活性；

3’→5’外切酶活性部分水解。2026/7/2859当用交错切割的限