CN115427562B 制备重组玻尿酸酶的方法 （阿特根公司）

2022.10.21PCT/KR2021/0103682021.08.06WO2022/031093KO2022.02.10WO2020022791A1,2020.01.30养基内的控制的葡萄糖浓度和降低的培养温度2其中所生成的PH20或其变体的N-聚糖的唾液酸化量为2.5至18且至18.6%，且甘露糖化量为47.9至54.4%，而且其中半乳糖化量和甘露糖化量之和不超过其中所述培养基中的玻尿酸酶活性为10000单2.如权利要求1所述的方法，其中所生成的PH20或其变体的比活性相较于野生型人类3.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(1)和4.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(1)和/或步骤(25.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(1)和6.如权利要求1所述的方法，其中所述PH20变体包含在野生型PH20的氨基酸序列中N-9.如权利要求1所述的方法，其中所述PH20或其变体的分离及纯化是使用所述PH20或12.如权利要求11所述的方法，其中酸性的玻尿酸酶PH20或其变体的移除是使用离子3尤其是野生型或成熟的野生型PH20或是野生型或成熟的野生型PH20氨基酸序列。[0002]玻尿酸酶(Hyaluronidase)系降解存在于胞外基质的玻尿酸的酵素。玻尿酸酶水解玻尿酸从而降低胞外基质中玻尿酸黏度并增加对组织(皮肤)的渗透性(Bookbinderetal.,2006)。玻尿酸酶已被用于提升由皮下注射(Muchmoreetal.,2012)或肌内注射(Krantzetal.,2016)提供的体液的吸收，以及改善局部麻醉的扩散(Clementet松(Ceftriaxone)(Harbetal.,2010)、胰岛素(Muchmoreetal.,2012)及免疫球蛋白(Wassermanetal.,2014)。玻尿酸酶亦可用于改善由静脉注射或血肿扩散而渗入组织的药物或液体的分散。在玻尿酸酶之中，在中性pH下具有活性的重组人类PH20蛋白由HalozymeTherapeuticsInc.开发，并以商标名“Hylenex”销售(Bookbinderetal.,[0004]对于生物制药开发而言，产品同一性及长保存期限系提供制备灵活性的重要因的各种化学及酵素修饰都会增加抗体中的净负电荷并减少pI值，从而形成酸性变体[0005]糖苷化(Glycosylation)系细胞(真核生物)中蛋白质的转译后过程，并发生于内4(asparagine-linkedglycosylation，ALG)酶添加有N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)等，最终合成Glc3Man9GlcNAc2-PP-Dol，其为一种脂质连接寡糖机制直接从核糖体转译至内质网。连接于蛋白质的N-聚糖由存在于内质网的葡萄糖苷酶(calnexin)及钙网伴护蛋白(calreticulin)的帮助下完成折叠。当所有葡萄糖都被切除的折叠时，会重复通过使一分子的葡萄糖进入钙连伴护蛋白/钙网伴护蛋白循环以提供完[0007]上述于内质网中的N-聚糖的生物合成的初始过程在从酵母菌(一种简单的真核微不同类型的聚糖。然而，这些多种聚糖通常亦共有一种核心位置，即三个甘露糖及两个cerevisiae)，其为一种众所周知的酵母菌。另一方面，具有缺乏甘露糖型(deficientmannosetype)(少甘露糖型(Pauci-mannosetype))的聚糖的糖蛋白被发现于昆虫细胞。胺转移酶(GNT)I用以将一个GlcNAc添加至Man5GlcNAc2，接着甘露糖苷酶II用以形成一个及唾液酸添加至GlcNAc的复杂聚糖结构。化的培养条件包含培养基中葡萄糖或谷氨酰胺的浓度(Tachibanaetal.1994)、溶氧(dissolvedoxygen，DO)的浓度(Restellietal.2006)、培养基的pH(Boryset5电荷的分布或是透过亲水性/疏水性的分布能够进一酸的酵素活性而言为必需，其中玻尿酸为一种具有大量负电荷分布于其中的物质(Arming具有大量负电荷的物质的玻尿酸结合至玻尿酸酶时，N-聚糖中的带负电的唾液酸加帽糖[0011]因此，重组玻尿酸酶PH20及其变体的生产力及活性会受N制及维持N-聚糖的程度而可用于工业上的玻尿酸酶PH20或其组玻尿酸酶PH20或其变体的宿主细胞的方法以及通过此方法制备的玻尿酸酶PH20或其变[0017](1)于35℃至38℃的培养温度培养表达重组玻尿酸酶PH20或其变体的宿主细胞至及6[0021]由根据本发明的制备方法所制备的PH20或其变体的特征在于所产生的PH20或其值应被解释为广义的意义，而非狭义的意义。宿主细胞可通过选自批次培养(batchculture)、重复批次培养(repeatedbatchculture)、馈料批式培养(fed-batchculture)、重复馈料批式培养(repeatedfed-batchculture)、连续培养(continuousculture)及灌注培养(perfusionculture)中的一种或多[0023]图1揭示对于野生型人类玻尿酸酶PH20及其变体的酵素活性、等电聚焦模式[0031]图3揭示对于制备玻尿酸酶PH20变体的细胞，取决于添加N-乙酰基-D-甘露糖胺[0036]图4为揭示取决于添加N-乙酰基-D-甘露糖胺(ManNAc)或半乳糖的培养条件的所[0037]图5揭示取决于添加N-乙酰基-D-甘露糖胺(ManNAc)或半乳糖的培养条件的所收获的用于制备玻尿酸酶PH20变体的细胞培养液的等电聚焦[0038]图6揭示取决于添加N-乙酰基-D-甘露糖胺(ManNAc)或半乳糖的培养条件的所收获的用于制备玻尿酸酶PH20变体的细胞培养液的N-聚糖结构[0039]图7揭示制备玻尿酸酶PH20变体的细胞的细胞生长、细胞生存力及氨浓度的变化7[0044]图8为显示随细胞培养天数的所收获的用于制备玻尿酸酶PH20变体的细胞培养液[0045]图9揭示随细胞培养天数的所收获的用于制备玻尿酸酶PH20变体的细胞培养液的[0046]图10揭示随细胞培养天数的所收获的用于制备玻尿酸酶PH20变体的细胞培养液[0054]图12为揭示取决于葡萄糖浓度的所收获的用于制备玻尿酸酶PH20变体的细胞培[0055]图13揭示取决于葡萄糖浓度的所收获的用于制备玻尿酸酶PH20变体的细胞培养[0056]图14揭示取决于葡萄糖浓度的所收获的用于制备玻尿酸酶PH20变体的细胞培养[0062]图16为揭示所收获的用于制备玻尿酸酶PH20变体的细胞的细胞培养液取决于pH[0063]图17揭示所收获的用于制备玻尿酸酶PH20变体的细胞培养液取决于pH程度的等[0064]图18为在玻尿酸酶PH20变体的纯化过程中透过初级阴离子交换树脂色谱法获得[0065]图19为在玻尿酸酶PH20变体的纯化过程中透过二级阴离子交换树脂色谱法获得[0066]图20为在玻尿酸酶PH20变体的纯化过程中透过阳离子交换树脂色谱法获得的纯8尿酸酶PH20或其变体的酵素活性及生产力而言30更佳为1.5至28最优选为2至25玻尿酸酶PH20或其变体的酵素活性及生产力会其唾液酸化量为2至25％且其甘露糖化量为47至60％时，玻尿酸酶PH20或其变体的酵素活[0073]更具体而言，根据本发明的制备N-聚糖中的唾液酸化量为1至38％的玻尿酸酶[0074](1)于35℃至38℃的培养温度培养表达重组玻尿酸酶PH20或其变体的宿主细胞至及于例如使用于培养的设备及试验者的操作熟练度的条件而会产生差异，故考虑这些差异，9[0079]从步骤(1)至步骤(2)的培养温度的降低在积分活细胞密度达到20x106至120x106个细胞x天/毫升时进行，优选为40x106至100x[0082]主要培养的细胞接种浓度可为1x105个细胞/毫升或更高，优选为5[0083]通过在根据本发明的PH20或其变体的制备中使用馈料批式培养与灌注培养的组[0085]于此所使用的“在培养过程中培养基中的剩余葡萄糖浓度维持于0.001g/L至[0087]由根据本发明的方法制备且于N-聚糖部分具有预定的唾液酸化、半乳糖化和/或甘露糖化程度的玻尿酸酶PH20或其变体在玻尿酸酶的培养基中的活性为10,000单位/毫升[0090]更具体而言，在根据本发明的制备玻尿酸酶PH20或其变体的方法中，在步骤(1)[0093]根据本发明的玻尿酸酶是指源自动物或如链霉菌属(Streptomyces)的微生物且列中N-末端和/或C-末端氨基酸残基的截断(truncation)且具有玻尿酸酶酵素活性的玻尿例如dhfr-CHO细胞(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77,4216-4220)或CHOK-1细胞(其为DHFR基因剔除的CHO细胞)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1968)60,1275)或CHOK-1细胞[0097]酵母菌的实施例包含Saccharomycessp.、Hansenulasp.、Kluyveromyces、[0098]在根据本发明的制备玻尿酸酶PH20或其变体的方法中，在步骤(1)和/或步骤(2)[0099]批次培养系在培养过程中不添加新鲜培养基或排放培养溶液的用于增殖细胞的养过程中连续或依序添加培养基。此培养方法即使连续排放培养溶液亦会防止细胞的排活性的增加系因由根据本发明的方法制备的玻尿酸酶PH20或其变体的N-糖苷化性质和/或[0102]在本发明中，葡萄糖及蛋白质之间的共价键的实施例包含N-糖苷键及O-糖苷键苷连接聚糖)，在O-糖苷键中N-乙酰基-D-半乳糖胺共价连接于丝氨酸或苏氨酸残基(O-糖N-糖苷连接聚糖及O-糖苷连接聚糖之一或二者的糖蛋白落于根据为1至68％、在N-聚糖量的唾液酸化量为1至38％且在N-聚糖量的甘露糖化量为40至63%,糖量的甘露糖化量为42至62更佳为在N-聚糖量的半乳糖化量为10至56％、在N-聚糖量的唾液酸化量为1.5至28％且在N-聚糖量的甘露糖化量为44至61最优选为在N-聚糖量的半乳糖化量为15至50％、在N-聚糖量的唾液酸化量为2至25％且在N-聚糖量的甘露糖化[0105]上述数值来自表1所示的实施例的实验结果，且系由具有95％信赖区间的数值而[0106]根据本发明的在N-聚糖量具有特定的唾液酸化和/或半乳糖化及甘露糖化量的玻酶PH20或其变体能通过经本领域具有通常知识者修改的其他方法市售可用的无血清培养基，例如HycellCHO培养基、ActiPro培养基(HyClone,USA)、CD(IrvineScientific,USA)、EX-AdvancedCHO馈料批式培养基(Sigma-Aldrich,[0108]在本发明中，用于培养细胞以表达糖蛋白的供料培养基(feedmedium)为无血清CHOEfficientFeedTMAAGTTM、CDCHOEfficientFeedTMBAGTTM、CDCHOEfficientFeedTMCAGTTM、CDCHOEfficientFeedTMAplusAGTTM、CDCHOEfficientFeedTMBplusAGTTM、CDCHOEfficientFeedTMCplusAGTTM(Gibco,USA)、BalancDgCHOFeed4(IrvineScientifAldrich,USA)、CHO-UFeedMixU1B7/CHO-UFeedMixU2B13(Kerry,USA)作为供料培养用市售可用的供料培养基，例如CellBoost系列补充培养基(HyClone,USA)、多种成分及成分浓度。此外，可使用市售可用的源自植物的[0111]用于增加或减少本发明中所使用的糖蛋白的N-聚糖量的添加物通常为已知涉及用改善与唾液酸化程度的提升相关的酵素的活性的启动子或是抑制去唾液酸化的抑制子。[0115]根据本发明的玻尿酸酶PH20或其变体的分离及纯化优选为不使用亲和性结合而是使用玻尿酸酶PH20或其变体的离子键和/或疏水性相互作用特性来进行，但本发明不限有固定反应性的单一活性位置的酵素的催化反应的速率，例如玻尿酸酶，遵循米氏稳态(pseudo-steadystate)，假设透过通过进行维持足够高物质浓度的反应来充分降低酵素的浓度而满足d[ES]/dt≒0。由于假设快速平衡或拟稳态的动力学公式系以相同方式[0124]赖威佛氏-柏克氏(Lineweaver-Burk)方程式用于实验分析使用米氏(Michaelis-验中给定物质浓度的倒数1/[S]之间的关系。此方程式为线性方程式的统计验证表示酵素结来降低用于达到具有高能量的过渡态的活化能。用于达到此过渡态的平衡常数正比于发明的变体相较于野生型PH20具有较高的kcat/KM的情况下，当将包含于聚合药理活性物kcat(物质转换速率)及kcat/Km(酵素催化效率)。这些结果表示根据本发明的PH20变体优[0130]实施例1，玻尿酸酶的活性、N-聚糖及等电聚焦模式(isoelectricfocusing以移除末端的唾液酸的样品以及使用唾液酸酶A及半乳糖酶处理以移除末端的唾液酸及半于末端的唾液酸时酸性部分的等电聚焦模式或酵素活性相似于碱性部分的等电聚焦模式[0133]基于评估源自不同培养细胞的野生型及多种变异的玻尿酸酶的结果进一步说明[0143]如表1所示，制备了多种类型的玻尿酸酶PH20及变异蛋白并调查了N-聚糖量。为culture)、利用使用重组基因所产生的细胞株殖株的细胞株殖株培养(celllinecloneculture)以及使用具有高生产力的经筛选的单株的细胞株培养(celllineculture)。于含研究用细胞库(researchcellbank，RCB、生产用主细胞库(productionmastercell[0144]细胞株殖株试验培养#1是使用HycellCHO培养基(HyClone,USA)不调整培养温度所收获的细胞培养液是使用于8L批次中含有EX-AdvancedCHO馈料批式培养基(Sigma-Aldrich,USA)与Cotton100UF(Gibco)及BalancDgCHOFeed4(Irvine为高盐溶析部分。细胞株试验培养#1是通过使用于2L批次中含有EX-CELLeAdvancedCHO馈料批式培养基(Sigma-Aldrich,USA)与Cotton100UF(Gibco)及CHOFeed4(IrvineScientific,USA)的馈料批式方法在37℃的培养温度下培养，并接着在积分活细胞密度达到预定程度时将培养温度调整至32℃而获得。细胞株试验培养#2是通过使用于10L批次中含有EX-CELL®AdvancedCHO馈料批式培养基(Sigma-Aldrich,USA)与Cotton100UF(Gibco,USA)及CDCHOEfficientFeedTMBplusAGTTM(Gibco,USA)的馈料批式方32℃,随后进行培养12天而获得。细胞株试验培养#3是通过使用于50L批次中含有EX-CELLAdvancedCHO馈料批式培养基(Sigma-Aldrich,USA)与Cotton100UF(Gibco,USA)及CDCHOEfficientFeedTMBplusAGTTM(Gibco,USA)的馈料批式方法在37℃的培养温株试验培养#4是通过使用于10L批次中含有EX-AdvancedCHO馈料批式培养基(Sigma-Aldrich,USA))与Cotton100UF(Gibco,USA)及CDCHOEfficientFeedTMBplus养#2、细胞株培养#3及细胞株培养#4是通过使用于200L批次中补充EX-AdvancedCHO馈料批式培养基(Sigma-Aldrich,USA)与Cotton100UF(Gibco,USA)及CDCHOEfficientFeedTMBplusAGTTM(Gibco,USA)的馈料批式方法在37℃的培养温度下培养研施例2至5的针对培养条件的实验以建立用于维持N-聚糖程度的培养方[0145]从表1可看出，野生型人类玻尿酸酶PH20及其变体以及哺乳动物玻尿酸酶PH20在N-聚糖中的半乳糖化程度应为15至50％、唾液酸化程度应为2.5至28％且甘露糖化程度应为47至60并且在对试验结果应用95％信赖区间时，N-聚糖半中的乳糖化程度应为1至或更少时才能制备出具有高于野生型人类PH20的活性的活性而因此可用于工业上的玻尿表达出10,000单位/毫升或更多的酵素表达程度，从而提出以高效率及低成本制备高质量[0149]将玻尿酸酶PH20变体以2x106个细胞/毫升接种于补充有或没有Cotton200UF(Gibco,USA)及20mMN-乙酰基-D-甘露糖胺(NZP,Netherlands)或50mM半乳糖(Pfanstiehl,USA)的含有EX-AdvancedCHO馈料批式培养基(Sigma-Aldrich,USA)心10分钟以获得培养上清液。通过HPLC及浊度分析确定在上述条件下培养的样品的活性，充有N-乙酰基-D-甘露糖胺的培养基，补充有20mMN-乙酰基-D-甘露糖胺的培养基表达出[0151]将表达玻尿酸酶PH20变体的细胞以2x106个细胞/毫升接种于Sartorius200L生物反应器中的EX-CELL8AdvancedCHO馈料批式培养基(Sigma-Aldrich,USA)。在培养的[0153]将表达玻尿酸酶PH20变体的细胞以2x106个细胞/毫升接种于Sartorius2L生物反应器中的EX-CELL®AdvancedCHO馈料批式培养基(Sigma-Aldri二天，使用Cotton200UF(Gibco，USA)及CDCHOEfficientFeedTMBplusAGTTM培养基EfficientFeedTMBplusAGTTM培养基(Gibco,USA)作为供料培养基每日以2L生物反应器在实际培养中，当所量测的培养上清液中的葡萄糖浓度达到0g/L的下限时，进一步加入1g/L)浓度及3g/L(±1g/L)浓度，2g/L的浓度条件对应1g/L(±1g/L)浓度条件的上限并对[0158]将表达玻尿酸酶PH20变体的细胞以2x106个细胞/毫升接种于Sartorius2L生物反应器中的EX-AdvancedCHO馈料批式培养基(Sigma-Aldrich,USA)。在培养的第二天，使用Cotton200UF(Gibco,USA)及CDCHOEfficientFeedTMBplusAGTTM培养基AGTTM培养基(Gibco,USA)作为供料培养基每日以2L生物反应器中培养起始体积的1.88%℃及10,000rpm下离心60分钟获得培养上清液。通过HPLC及浊度分析确定在上述条件下培pH而变化以及最高的活性及最低的唾液酸化程度，这相较于一般条件为改善的条件(表2、[0164]使用30kDaMWCO膜过滤器透过UF/DF控制导电性及pH，将培养溶液的条件重新调整至第一阴离子交换管柱平衡条件。使用适当浓度的溶剂/界面活性剂处理经重新调整的[0166]将经过滤的蛋白质溶液通过初级阴离子交换管柱以透过阴离子交换树脂捕获玻[0168]将经过滤的蛋白质通过二级阴离子交换管柱以利用阴离子树脂交换移除酸性的使用相同.Bistris缓冲液冲洗管柱(初级冲洗)。在初级冲洗后，使用相同Bistris缓冲液[0170]将经重新调整的蛋白质溶液通过阳离子交换管柱以利用阳离子交换树脂移除酸[0172]在阳离子交换管柱步骤后，透过1微米过滤器过滤含有期望的玻尿酸酶的蛋白质浓度，并使用8kDaMWCO膜过滤器透过UF/DF重新调整以与含有145mM盐的pH7.0组氨酸缓应的酵素及250μL的酸性白蛋白溶液加入96孔盘的各孔中并摇晃10分钟，使用分光亮度计在600奈米量测吸亮度。样品的活性单位使用活性单位已知的标准品的试验结果与样品的[0177]使用预凝胶(precastgel)(pH3-7,Invitrogen)及用于等电聚焦的缓冲溶液分[0179]玻尿酸酶的N-聚糖程度透过标记N-聚糖样品来分析，透过以PNGaseF(N-糖苷酶Amide管柱(Waters)进行超高效液相色谱。将经纯化的玻尿酸酶样品去盐并以PNGaseF在离。以用荧光侦测器(FLD)侦测经分离的样品以分析N-聚糖程度。将各个分离的N-聚糖分M9等)相加以确定甘露糖化百分比(％)[0182]为了研究源自动物的类人猿(anthropoid)(即倭黑猩猩)及偶蹄目(即羊)的玻尿[0187]使用ExpiCHO表达系统进行表达。当ExpiCHO细胞的数量达到6x106个细胞/毫升时，使用ExpiFectamineCHO试剂以玻尿酸酶PH20cDNA插入pcDNA3.4-TOPO载体的质体转[0189]使用AKTAprime系统(GEHealthcareSystems)透过两步骤的管柱色谱纯化在基(CV)的缓冲液A冲洗管柱以移除非特异性结合蛋白，并接着以5CV的缓冲液B在0至100%[0192]为了使用HisTrapHP管柱进行蛋白质存化，制备缓冲液A(20mM磷酸钠，500mMHisTrapHP管柱，以7CV的7％缓冲液B冲洗管柱以移除非特异性结合蛋白，接着以3CV的[0196]为了分析根据本发明的变体的酵素动力学，通过Morgan-Elson方法(Takahashi,法，其以对二甲基氨基苯甲醛(DMAB)(即Eh比色反应。在反应后于545nm量测吸亮度，使用上述的GlcNAc的标准反应曲线量测酵素活遵循米氏(Michaelis-Menten)酵素动[0197]表4揭示在实施例1的表1中的样品的中从细胞株殖株试验培养#2获得的部分#1及[0201]根据本发明的制备重组玻尿酸酶PH20蛋白质或其变体的方法能够制备具有高生enzymeforenhancedinterstitialtranspo.114,230-241.[0205]2.DouglasB.Muchmore,M.D.,andDanielE.Vaughn,Ph.D.(2012).AcceleratingandImprovingtheConsistencyofRapid-ActingAnalogInsulinAbsorptionandActionforBothSubcutaneousInjectionandContinuousSubcutaneousInfusionUsingRecombinantHumanHyaluronidase.J.DiabetesSci.andTechnol.6(4):764[0206]3.E.M.Krantz.(1980).Low-doseintramuscular161-2.hyaluronidaseinnasalinfiltration:prospectiverandomizedcontrolledpilotstudy.J.Laryngol.Otol.117(8):614-8.J.(2009).TheINFUSE-Morphinestudy:useofrecombinanthumanhyaluronidase(rHuPH20)toenhancetheabsorptionofsubcutaneouslyadministeredmorphinepatientswithadvancedillness.J.PainandSymptomManag.38([0209]6.GeorgeHarb,FrancoisLebel,JeanBattikha,JeffreyWThackara.(2010).Safetyandpharmacokineticsofsubcutaneousceftriaxonewithoutrecombinanthumanhyaluronidase(rHuPH20)versusintravenous88.[0210]7.RichardL.Wasserman.(2014).Overviewofrecombinanthumanhyaluronidase-facilitatedsubcutaneousinfusionofIgGinprimaryimmunodeficiencies.Immunotherapy.6(5):553-67.[0211]8.HarrisR.J.,ShireS.J.,WinterC.(2004).Commercialmanufacturingscaleformulationandanalyticalcharacterizationoftherapeuticrecombinantantibodies.Drug.Dev.Res[0212]9.StephanSchilling,TorstenHoffmann,FredRosche,SusanneManhart,ClausWasternack,andHans-UlrichDemuth.(2002).HeterologousExpressionandCharacterizationofHumanGlutaminylCyclase:EvidenceforaDisulfideBondwithImportanceforCatalyticActivity.Biochemistry,35,10849-10857.(1994).Changesofmonosaccharideavailabilityofhumanhybridomaleadtoantibody.Cytotechnology.16(3):151-7.[0214]11.VeronicaRestelli,Ming-DongWang,NormanHuzel,MaPerreault,MichaelButler.(2006).Theeffectofdissolvedoxygenontheproductionandtheglycosylationpro