2027创新设计一轮生物第51讲　基因工程的基本工具和基本操作程序

基因工程的基本工具和基本操作程序第51讲课标要求1.阐明重组DNA技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.活动：DNA的粗提取与鉴定实验。4.活动：利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。考情分析1.重组DNA技术的基本工具2025·江苏卷，19；2024·江西卷，12；2024·山东卷，5；2023·新课标卷，62.DNA的粗提取与鉴定2025·四川卷，5；2025·湖南卷，2；2025·陕晋宁青卷，5；2025·江苏卷，23；2024·安徽卷，14；2024·河北卷，13；2024·山东卷，13；2023·福建卷，4；2023·广东卷，113.DNA片段的扩增与电泳鉴定2025·福建卷，6、15；2025·新课标卷，6；2024·海南卷，15；2024·浙江6月选考，20；2024·江西卷，19；2024·黑吉辽卷，7；2023·江苏卷，22；2023·山东卷，254.基因工程的基本操作程序2025·陕晋宁青卷，21；2025·黑吉辽蒙卷，25；2025·安徽卷，15；2025·河北卷，22；2025·江西卷，11；2025·湖南卷，21；2024·重庆卷，19；2024·湖南卷，21；2024·甘肃卷，24；2024·安徽卷，20；2024·河北卷，22；2024·全国甲卷，38；2024·山东卷，25；2024·新课标卷，35；2024·黑吉辽卷，25；2023·全国乙卷，38；2023·全国甲卷，38；2023·湖北卷，4；2023·广东卷，201目

录重组DNA技术的基本工具2基因工程的基本操作程序3DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定考点一重组DNA技术的基本工具核心要点·再研典型例题·深研1.基因工程的概念转基因

生物产品DNA分子遗传性状2.基因工程的工具 (1)限制性内切核酸酶——“分子手术刀”磷酸二酯键黏性末端①将一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。②限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。

(2)DNA连接酶——“分子缝合针”限制酶①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的核酸片段上。②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。

(3)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”质粒限制酶切割位点[创新拓展]

基因工程中限制酶的选择、标记基因与重组表达载体的筛选1.限制酶的选择原则 (1)根据限制酶切割位点的位置确定限制酶的种类①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst

Ⅰ。②不能选择切割位点位于目的基因和标记基因内部的限制酶，如图甲、乙不能选择Sma

Ⅰ。③善用“双酶切”，注意方向性。“双酶切法”可防止载体和目的基因环化，避免目的基因与载体反向连接。目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的，否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择Pst

Ⅰ和EcoRⅠ两种限制酶。④巧用“同尾酶”。同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。提醒同尾酶要慎用，多数同尾酶虽然切割形成的黏性末端对应序列相同，但黏性末端两侧的识别序列并不相同，连接后的序列无法再被识别和酶切，除非使用仅识别黏性末端序列的限制酶进行切割，如下图所示。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类提醒保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则。如图乙中不选择Sma

Ⅰ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率，防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。(3)根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下：[例1]

利用图1中目的基因和图2中P1噬菌体载体构建图3中的重组DNA，限制酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。请回答问题。(1)用BglⅡ和Sau3AⅠ分别切割目的基因和P1噬菌体载体，这两种限制酶的识别序列和切割位点均不相同，但切出的DNA片段的特点是_________________________。具有相同的末端序列(2)只用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，在构建表达载体时，可能出现的问题是什么？__________________________________________________________________________________________________________________________。(3)只有用

和

切割目的基因和P1噬菌体载体，构建的重组DNA中RNA聚合酶在插入目的基因上的移动方向，才会与图3一致。

出现正向连接、反向连接、目的基因自身环化、P1噬菌体载体环化等多种连接方式EcoRⅠSau3AⅠ2.标记基因与重组表达载体的筛选 (1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。(2)细菌有三种：未转化的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。(3)筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图中1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即含有重组质粒的菌落，如图中1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。[例2]

幽门螺杆菌(Hp)的Ipp20基因编码其特有的蛋白质，研究者欲利用基因工程制备Hp疫苗。3种常见的限制酶识别序列如图1所示，该实验所用的质粒结构如图2所示，基本操作流程如图3所示。(1)该基因工程中，构建基因表达载体时选用的限制酶是_____________________。XbaⅠ、XhoⅠ(2)为筛选出含有目的基因的大肠杆菌，实验可以采用影印法：用无菌毡布压在培养基A的菌落上，带出菌种，平移并压在培养基B上，培养一段时间后的结果如图3所示，数字表示不同的菌落。培养基A中添加的抗生素是

，培养基B中添加的抗生素是

。图3中符合要求的菌落是

(填数字)，请说明理由。___________________________________________________________________________________________________________________________。潮霉素氯霉素3、5

符合要求的菌落，应该能在含潮霉素的培养基上生长，但不能在含有氯霉素的培养基上生长考向

基因工程的三种工具[科学思维]1.(2023·新课标卷，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(

)A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA连接酶连接B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接C解析酶3切割后得到的是平末端，为使其高效连接，应该用T4DNA连接酶连接，A不符合题意；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B不符合题意；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C符合题意；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D不符合题意。2.(2026·辽宁本溪模拟)限制性内切核酸酶HindⅢ和XhoⅠ的识别序列及切割位点分别为A↓AGCTT和C↓TCGAG，下列相关叙述正确的是(

) A.两种限制酶是在同一种生物中分离出来的 B.两种限制酶切割DNA形成的黏性末端相同 C.用HindⅢ酶切割含目的基因的DNA片段和用XhoⅠ酶切割质粒后，目的基因和质粒能连接成重组质粒 D.实验中可通过控制反应时间、酶的浓度等控制酶切效果D解析限制酶命名规则为属名首字母＋种名前两个字母＋菌株或血清型＋同菌株的多种限制酶流水号(罗马数字)，由此可知HindⅢ和XhoⅠ是从不同的生物中分离得到的，A错误；两种限制酶识别和切割的序列分别为A↓AGCTT和C↓TCGAG，则两者切割后形成的黏性末端分别是AGCT－、TCGA－，B错误；两种限制酶切割形成的黏性末端不同，无法连接成重组质粒，C错误。3.(2026·湖北十堰模拟)质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是(

)C项目细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长情况细菌在含四环素的培养基上生长情况①能生长不能生长②能生长能生长③不能生长能生长A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点B.①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是bC.质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个D.将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶解析质粒的复制原点上有DNA聚合酶的结合位点，A错误；①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是b，②是c，③是a，B错误；将外源基因与质粒连接时需用DNA连接酶，D错误。与DNA有关的几种酶的比较考点二基因工程的基本操作程序核心要点·再研典型例题·深研1.目的基因的筛选与获取 (1)筛选合适的目的基因编码蛋白质结构功能序列数据库(2)利用PCR获取和扩增目的基因引物脱氧核苷酸耐高温温度两种引物

耐高温的DNA聚合酶指数形式琼脂糖凝胶电泳①在PCR过程中实际加入的原料为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。②引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3′端，其作用使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。③复性温度过高，则引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR产物。④真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。

2.基因表达载体的构建——核心受体细胞RNA聚合酶受体细胞中是否含有目的基因标记基因限制酶3.将目的基因导入受体细胞目的基因子房T－DNA染色体显微注射受精卵(1)农杆菌特点①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞中，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。(2)农杆菌转化法中的两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。(3)导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。

4.目的基因的检测与鉴定PCR抗原—抗体杂交[创新拓展]

PCR的应用 PCR不仅可以扩增目的基因，而且可以在DNA两端添加酶切位点、对DNA进行定点突变，以及用于检测目的基因。 (1)利用引物添加酶切位点(2)利用引物诱变DNA分子(3)利用PCR检测目的基因1.(2025·福建卷，10)紫杉醇是红豆杉的代谢产物，会干扰纺锤体的正常功能。科研人员利用农杆菌将紫杉醇合成的相关基因导入烟草中，实现了紫杉醇前体物质的合成。下列叙述错误的是(

)A.农杆菌转化前应先使用Ca2＋处理烟草细胞B.紫杉醇合成的相关基因会整合到烟草染色体DNA上C.紫杉醇因干扰肿瘤细胞的有丝分裂而具有抗癌作用D.该技术的突破有利于红豆杉天然资源的保护A解析农杆菌转化前，需要将含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌中，此时应先使用Ca2＋处理农杆菌细胞，使农杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，A错误；农杆菌的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体DNA中，因此紫杉醇合成的相关基因会随T－DNA整合到烟草染色体DNA上，B正确；紫杉醇会干扰纺锤体的正常功能，通过抑制纺锤体的形成，阻碍肿瘤细胞的有丝分裂，从而发挥抗癌作用，C正确；利用转基因技术生产紫杉醇前体物质，可减少对天然红豆杉的采伐，有利于保护其天然资源，D正确。2.(2025·陕晋宁青卷，21)马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。

(1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、

、含Mg2＋的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的

步骤中起作用。(2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的

(填“5′端”或“3′端”)添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5′－

－3′，切割载体时应选用的两种限制酶是

。PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。

(4种)脱氧核苷酸延伸5′端AGATCTBamHⅠ与EcoRⅠ

(3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T－DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到

上，抗性基因

可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经

形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。

染色体DNA2再分化解析

(1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、(4种)脱氧核苷酸、含Mg2＋的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。PCR过程一般可以分为变性、复性、延伸，DNA聚合酶在延伸步骤中起作用，即DNA聚合酶将脱氧核苷酸加到引物的3′端进行子链的延伸。(2)为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需要在引物的5′端添加相应的限制酶识别序列。为保证目的基因的正确插入，应使用双酶切；载体中含有BamHⅠ、EcoRⅠ和Xba

Ⅰ的酶切位点，S基因上含有Xba

Ⅰ、Nde

Ⅰ、BamHⅠ的酶切位点，为保证S基因结构的完整性，不能在S基因两端添加Xba

Ⅰ、Nde

Ⅰ、BamHⅠ的识别序列；分析表格数据，Bgl

Ⅱ切割产生的黏性末端和BamHⅠ切割产生的黏性末端相同，结合S基因的转录方向和载体上启动子的转录方向可知，

应在上游引物添加

Bgl

Ⅱ的识别序列，即5′－AGATCT－3′，

下游引物添加EcoRⅠ的识别序列。因此，切割载体应选用的两种限制酶为BamHⅠ和EcoRⅠ。(3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，农杆菌能将基因表达载体中的T－DNA转移到愈伤组织细胞的染色体DNA上。分析载体，T－DNA中含有抗性基因2，

若T－DNA成功整合到被侵染细胞的染色体DNA上，则该细胞具有抗性基因2对应的抗性，因此，抗性基因2可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、

根，继续培育可获得抗寒能力显著增加的马铃薯植株。目的基因的获取方法(1)利用PCR获取和扩增目的基因。(2)人工合成目的基因(3)从基因文库中获取目的基因根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。

考点三DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定核心要点·再研典型例题·深研1.DNA的粗提取与鉴定 (1)实验原理不溶于2mol/L

二苯胺(2)实验步骤(3)注意事项2.DNA片段的扩增及电泳鉴定 (1)实验基础可解离相反琼脂糖凝胶电泳大小和构象(2)PCR实验操作步骤(3)电泳鉴定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为______________的紫外灯下被检测出来。微量移液器离心管底部PCR仪300nm①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。②在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。③电泳时，DNA的相对分子量越大，迁移速率越慢；DNA的相对分子量越小，迁移速率越快。

(1)土豆DNA溶于酒精后，与二苯胺试剂混合呈蓝色。(2025·四川卷，5A)(

)提示沸水浴条件下。(2)DNA的粗提取与鉴定实验可用“猪成熟红细胞”替代“猪肝细胞”。(2025·湖南卷，2A)(

)提示猪成熟的红细胞没有细胞核和众多细胞器，不含DNA。(3)在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快。(2024·黑吉辽卷，7C)(

)提示在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢。×××(4)粗提取DNA时的过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解。(2022·山东卷，13A)(

)(5)动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行。(2022·湖北卷，5A)(

)提示动、植物细胞的DNA提取不需要在无菌条件下进行。√×考向1

DNA的粗提取与鉴定[科学探究]1.(2024·安徽卷，14)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(

) A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质D解析若将研磨液更换为蒸馏水，则从细胞核中释放出的DNA量会减少，从而会降低DNA提取的效率，A正确；由于DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，所以利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA，B正确；DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液，利用该原理可纯化DNA粗提物，C正确；二苯胺试剂可以用于鉴定DNA，不能检测出溶液中是否含有蛋白质杂质，D错误。2.(2024·山东卷，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是(

)A.整个提取过程中可以不使用离心机B.研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰A解析在DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液倒入烧杯，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正确；研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应将上清液倒入烧杯中，B错误；鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误；加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个加二苯胺不加DNA的对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。考向2

DNA片段的扩增及电泳鉴定[科学探究]3.(2025·新课标卷，6)琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～4的电泳结果如图所示(“＋”“－”分别代表电泳槽的阳极和阴极)。已知样品1和2中的D