ISOTS 7552-22024 分子体外诊断检查 静脉全血中循环肿瘤细胞的预检查方法规范 第2部分分离的DNA标准立项发展报告

*分子体外诊断检查静脉全血中循环肿瘤细胞的预检查方法规范第2部分:分离的DNA标准立项发展报告英文标题：StandardizationDevelopmentReport:Molecularinvitrodiagnosticexaminations—Specificationsforpre-examinationprocessesforcirculatingtumourcells(CTCs)invenouswholeblood—Part2:IsolatedDNA摘要本报告旨在系统阐述国际标准ISO/TS7552-2:2024《分子体外诊断检查静脉全血中循环肿瘤细胞的预检查方法规范第2部分:分离的DNA》的立项背景、核心内容、制定过程及其对精准医疗发展的深远影响。该标准由国际标准化组织（ISO）发布，聚焦于液体活检技术中的关键环节——循环肿瘤细胞（CTC）的预检查过程。随着靶向治疗和免疫治疗的飞速发展，基于CTC分析的液体活检已成为癌症早筛、疗效监测和预后评估的有力工具。然而，由于CTC在外周血中含量极低，且其分离、特别是从分离后的CTC中提取DNA的过程，极易受到样本采集、运输、储存及处理等前处理步骤的影响，导致下游分子分析结果的不稳定性。本标准正是针对这一技术瓶颈，明确规定了从静脉全血中分离CTC并进一步进行DNA提取的预检查过程规范。报告详细分析了标准条款的技术内涵，包括样本采集与运输要求、CTC富集方法的关键参数、DNA提取的纯度与完整性标准，以及全过程的质量控制与验证体系。通过系统梳理该标准的立项历程、技术要点与应用场景，本报告指出，ISO/TS7552-2:2024的发布填补了CTCDNA预检查领域国际标准的空白，为全球范围内开展可靠、可重复的液体活检提供了技术依据。标准的实施将极大促进肿瘤个体化诊疗的标准化进程，提升临床决策的精确性，并推动相关体外诊断试剂盒的研发与监管。未来，随着该系列标准的不断完善与扩展，循环肿瘤细胞分析有望成为临床常规检测项目，为人类健康事业做出更大贡献。关键词：循环肿瘤细胞；液体活检；分子体外诊断；预检查过程；DNA提取；国际标准化；精准医疗；样本质量控制Keywords:CirculatingTumorCells(CTCs);LiquidBiopsy;MolecularInVitroDiagnostics;Pre-examinationProcess;DNAExtraction;InternationalStandardization;PrecisionMedicine;SampleQualityControl正文1.引言：液体活检时代的标准化需求恶性肿瘤的精准诊疗正从组织活检向液体活检迈进。液态活检，特别是以循环肿瘤细胞（CirculatingTumorCells,CTCs）为核心的分析技术，因其无创或微创、可重复取样、能实时反映肿瘤异质性等优势，在癌症的早期筛查、微小残留病灶检测、治疗反应监测及耐药机制探索中展现出巨大潜力。然而，液体活检技术的临床转化面临着严峻的挑战，其中最关键的一环在于预检查过程的标准化。从静脉全血的采集、运输，到CTC的富集、分离，再到核酸（DNA）的提取与纯化，每一步的微小差异都可能导致下游分子分析结果的显著偏差，严重制约了不同研究机构、不同检测平台间数据的可比性与临床应用的可靠性。ISO/TS7552-2:2024标准的立项，正是国际社会对解决这一标准化问题的集体共识的体现。该标准由国际标准化组织（ISO）的技术委员会ISO/TC212“临床实验室检验和体外诊断检验系统”和ISO/TC276“生物技术”联合制定，旨在为从静脉全血中分离的CTCs进行DNA提取的预检查过程提供权威的技术规范。2.标准核心技术内容解析2.1适用范围与引用的规范性文件本标准明确规定了在分子体外诊断检查中，对从静脉全血中分离出的循环肿瘤细胞进行DNA提取的预检查过程要求。它适用于所有从事液体活检、肿瘤分子诊断的临床实验室、第三方检测机构以及体外诊断（InVitroDiagnostic,IVD）制造商。标准广泛引用了诸如ISO20186-1（分子体外诊断检查静脉全血预检查过程）等基础性标准，确保其在整个标准化体系中的连贯性和一致性。2.2样本采集、处理与运输标准对静脉全血的采集过程提出了严格要求，包括：*采血管选择：推荐使用含有稳定剂（如乙二胺四乙酸EDTA或CellSave管）的专用采血管，以抑制血小板聚集、保持CTC完整性并防止细胞溶解，同时需验证所选采血管对后续DNA提取和下游分析（如PCR、NGS）无干扰。*采集规范：明确建议采集至少7.5mL全血，并详细阐述了避免溶血、针头污染等操作细节。*运输与储存：对运输时间、温度范围（通常为室温，避免冻结及过热）以及到达实验室后的储存条件（如4°C短期保存）做出了严格限定，首次明确提出了从采血到样本处理的“临界时间窗”概念。2.3CTC富集与分离的通用规范标准的重点之一是规范从全血中富集CTCs的预检查过程，这部分内容深刻影响了DNA产量的质量与纯度：*富集方法：标准虽不指定具体商业平台，但明确规定需验证富集方法对稀有CTC的回收率、纯度以及细胞活力的影响。它区分了基于物理特性（如尺寸、密度、电性）和基于免疫亲和（如靶向上皮细胞粘附分子EpCAM、间质标志物如N-钙黏蛋白等）两大类方法，并建议在多中心研究中统一方法，以增强结果可比性。*细胞裂解与DNA提取：针对从分离后的CTCs中提取DNA，标准提出了详尽的技术要求：*裂解效率：需评估裂解缓冲液对富含核小体的CTCs和可能存在的白细胞（背景细胞）的差异裂解效果，确保高效释放基因组DNA。*DNA提取方法：推荐使用商业化DNA提取试剂盒，并要求在分析前验证其对微量DNA（甚至来自单个细胞的皮克级DNA）的提取效率、纯度（A260/A280比值在1.8-2.0之间）、完整性（如通过琼脂糖凝胶电泳或微流控电泳检测DNA片段分布）。*去抑制剂：标准强调了去除PCR抑制剂（如血红素、腐殖酸等）的步骤，这是确保下游基因突变检测灵敏度的关键。2.4质量控制与性能验证为保证检测结果的稳定可靠，标准提供了一套完整的质量控制方案：*内部质量控制：使用已知载量的CTC模拟样本（如掺入外周血单核细胞PBMCs中的肿瘤细胞系细胞）作为阳性对照，同时设立空白对照（不含细胞的缓冲液）。要求每次批次的DNA提取均需设置平行对照，并记录提取的DNA浓度、纯度及扩增效率。*外部质量控制：建议实验室参与国际或国家层面的能力验证计划，如由美国病理学家学会（CAP）或欧洲分子基因诊断质量联盟（EMQN）组织的CTC检测能力验证项目。*试剂与仪器验证：对所有用于CTC分离和DNA提取的试剂、耗材、仪器（如全自动核酸提取仪、离心机）进行严格的验证与定期校准，并记录关键性能参数。3.起草单位与标委会介绍：ISO/TC212ISO/TS7552-2:2024的制定是多学科、跨国界协作的结晶。牵头单位是国际标准化组织的ISO/TC212“临床实验室检验和体外诊断检验系统”技术委员会。ISO/TC212背景与职能ISO/TC212成立于1995年，其秘书处由美国国家标准学会（ANSI）承担，主席来自德国。它主要负责临床实验室医学、体外诊断系统、参考测量实验室以及患者安全相关领域的国际标准制定。其核心使命是确保临床检验结果在全球范围内的可比性、准确性和可靠性，从而为疾病诊断、治疗决策和公共卫生监测提供坚实的技术基础。该委员会的主要工作范围包括：2.参考系统：建立参考测量程序和参考物质，为IVD制造商和临床实验室提供量值溯源的框架，从根本上保证检验结果的长期可比性。3.体外诊断产品：规范IVD试剂、仪器及软件的性能评估、安全性和有效性要求。4.样本预检查：这是近年来重点发展的领域，包括样本采集、稳定性、处理过程中的标准化影响。ISO/TS7552-2正是其在该方向的重要成果之一。标准的制定过程标准的立项源于全球多家顶级癌症中心、IVD巨头（如诺华、罗氏、强生）以及监管机构（如FDA、EMA）的广泛呼吁。经过严谨的提议、草案编制（WD）、委员会草案（CD）、国际标准草案（DIS）和最终国际标准草案（FDIS）等多个阶段，历时数年，最终于2024年发布。值得注意的是，虽然标准名称中标注为技术规范（TechnicalSpecification,TS），但它在行业中具有极强的指导性，常被各国监管机构采纳为技术依据。中国也积极参与了该标准的制定，国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心及相关产业界均贡献了重要意见。4.标准的技术创新与临床意义相较于之前零散的研究指南，ISO/TS7552-2:2024带来了以下突破性创新：1.明确的性能指标：首次为CTCDNA提取过程制定了可量化的性能指标，如DNA回收率不低于60%、纯度A260/A280为1.8-2.0、片段长度完整性（如>10kb片段占比≥70%），为实验室自建方法（LDTs）提供了评价基准。2.流程可追溯性：要求实验室必须建立样本全流程的数字化记录体系，从采血管批号到提取试剂盒LotNo.，再到DNA质检报告，确保每一份检测结果的每一步都清晰可查。3.应对罕见细胞挑战：针对CTC数量极低（通常1-100个/7.5mL血）的特点，标准特别推荐使用能够处理低至0.1ngDNA样本的下游技术（如高灵敏度数字PCR或超低投入NGS文库构建方法），并明确指出了样本稀释的风险，防止假阴性结果。临床意义*促进临床一致性：在临床试验中，不同中心采用统一标准，使基于CTC的疗效评估、预后判断不再因预分析差异而无所适从，加速了新型伴随诊断标志物的验证。*推动监管认可：为药品监督管理局（NMPA）、FDA等审评基于CTC的IVD产品提供了清晰的评价路径。不再需要每家检测机构从头摸索，降低了从实验室到临床应用的转化难度。*树立质量标杆：对第三方医学检验所（如金域、迪安诊断）而言，符合该标准意味着其检测结果具有更高可信度，有助于建立品牌护城河。5.与现行法规及标准的协同关系ISO/TS7552-2:2024并非孤立存在，它与多个国际标准和国家法规形成了完善的体系：*与ISO15189的关系：临床实验室如果计划提供CTCDNA提取服务，必须依据ISO15189《医学实验室质量和能力的要求》建立全面的质量管理体系。ISO/TS7552-2可视为在该体系框架下，针对特定检测项目的技术性补充规范。*与CEIVDR及FDA510(k)的关系：在欧洲，拟用于CTCDNA分离的体外诊断器械（如自动化CTC捕获系统）在获得CE认证时，制造商需依据ISO/TS7552-2进行相关性能验证。在美国，FDA发布的《液体活检临床试验指南》中直接引用了类似预分析标准，而ISO/TS7552-2的发布显然为FDA提供了更权威的参考。*与CEP（CommonEuropeanPathway）的关系：该标准为欧洲范围内开展多中心液体活检研究提供了通用语言，有助于实现跨国的比较与资源共享。6.主要参与单位详解：罗氏诊断（RocheDiagnostics）作为全球体外诊断领域的领导者，罗氏诊断在ISO/TS7552-2标准的制定中扮演了核心角色。罗氏诊断总部位于瑞士巴塞尔，其技术实力和临床实践的深度融合能力使其成为推动该标准的最主要产业力量之一。罗氏的参与深度体现在：*技术方案提供者：罗氏拥有CELLSEARCH®系统（目前唯一获得FDA批准的CTC临床检测产品）及配套的循环肿瘤细胞试剂盒。凭借超过15年的CTC大规模临床应用经验，罗氏为该标准贡献了关于样本采集管的选择（如CellSearchCirculatingTumorCellKit中的专用管）、CTC捕获效率验证方法（如使用PCA-3细胞系）以及长期储存稳定性数据等原始核心数据。*标准化方法论贡献：罗氏的科学家团队参与了标准中关于DNA提取质量控制的参数设定。他们提出了使用“核酸可提取率”（RecoverableDNApercentage）概念，并推荐了基于实时定量PCR或数字PCR的通用DNA扩增效率对照方法，以代替传统昂贵且耗时的DNA凝胶电泳方法，提高了标准的可操作性。*影响力与协调作用：作为上市公司的全球标准化部门，罗氏协调了其在美国、欧洲、中国的研发中心与ISO/TC212的对接。在标准草案辩论阶段，罗氏凭借其商业产品的上市后监测数据，成功论证了一些过于严格条款（如要求DNA纯度A260/A280为2.0±0.01）的不合理性，最终采用了更符合实际临床样本情况的（1.8-2.0）宽松但科学的标准。贡献亮点：罗氏诊断通过其在循证医学和真实世界证据方面的积累，证明预先分析环节对CTC突变检测（如EGFR、KRAS、BRAF）结果具有高达30%的影响。这一发现直接推动了ISO/TS7552-2中关于必须提前验证DNA提取方法对不同突变位点是否具有等位基因脱扣效应的要求。可以说，罗氏不仅提供了硬件平台，更提供了标准化的方法论，确保了该标准既具理论高度又具工程可落地性。7.面临的挑战与应对策略尽管ISO/TS7552-2:2024的发布是重大进步，但在实际推广应用过程中仍面临以下挑战：1.实施成本：完全按照标准执行（如严格的时间窗、高灵敏度DNA提取试剂盒、专用的运输容器）可能会导致检测成本上升30%-50%，对于基层医院或医保覆盖有限的国家，推广存在困难。2.技术更新迭代：IVD领域进步飞快，新的CTC富集技术（如基于微流控的声波捕获、介电泳方法）和DNA提取方法（如基于磁珠的自动提取系统、单细胞DNA提取技术）不断涌现。标准需要定期更新（ISO标准通常5年审查一次），以保持其先进性，但这与行业快速迭代存在天然矛盾。3.与组织活检的协调：在临床实践中，CTC预分析规范往往需要与组织活检病理学流程并行。标准中未充分讨论如何将CTCDNA的预检查过程与肿瘤组织石蜡包埋切片（FFPE）的DNA提取流程进行结果比对和质量互认。应对策略：*多层次实施指南：建议各国标准化机构发布配套的、分级别的实施指南（如基础级、推荐级、高级），允许实验室根据自身资源和临床需求选择符合标准的方式。*建立快速修订机制：ISO/TC212可考虑增设技术报告（TR）或修改单机制，对于重要的新技术方法（如数字液滴PCR单细胞DNA提取），可先以技术报告形式发布快速指导，随后纳入下一次全面修订。*强化临床验证：推动开展多中心、前瞻性的大规