T∕ZNZ 338-2025 动物源肠杆菌科细菌含氯消毒剂抗性评价技术规范

CCSB45T/ZNZTechnicalcodeforchlorinateanimal-relatedoriginal2025-05-30发布浙江省农产品质量安全学会发布T/ZNZ338—2025I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由浙江省农产品质量安全学会提出并归口。本文件起草单位：浙江省农业科学院、中国计量大学、四川农业大学、浙江大学、浙江国伟科技有限公司。本文件主要起草人：肖兴宁、汪雯、邹立扣、杨华、赵珂、丁甜、肖英平、吕文涛、黄学涛。T/ZNZ338—20251动物源肠杆菌科细菌含氯消毒剂抗性评价技术规范本文件规定了动物源肠杆菌科细菌含氯消毒剂抗性的评价方法。本文件适用于动物源及环境中肠杆菌科细菌的含氯消毒剂抗性检测。第一法为肉汤稀释法，适用于次氯酸钠等热稳定性较差（<35℃)的含氯消毒剂；第二法为琼脂稀释法，适用于苯扎氯铵等热稳定性较强(≥35℃)的含氯消毒剂。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注明日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1参考敏感株referencesensitivestrain对抗生素、消毒剂等具有已知敏感性的标准生物菌株。第一法肉汤稀释法4试剂与材料4.1参考敏感菌株大肠埃希氏菌（Escherichiacoli，ATCC25922），在-70℃以下保存，传代不应超过5次。4.2灭菌水实验用水里对于消毒剂工作液配置应符合GB/T6682的规定，121℃灭菌15min；用于培养基配置应符合GB4789.28，121℃灭菌15min。4.30.85%灭菌生理盐水称取0.85g氯化钠溶于100mL灭菌水中，121℃灭菌15min。T/ZNZ338—202524.4培养基4.4.1MHB肉汤（Mueller-Hintonbroth）的制备见附录A.1。4.4.2TSA胰酪胨大豆琼脂（TryptoneSoyagar）的制备见附录A.2。4.4.3MHA琼脂（Mueller-Hintonagar）的制备见附录A.3。4.5含氯消毒剂工作液含氯消毒剂工作液应现配现用。使用灭菌水将消毒剂原液稀释成一系列浓度梯度备用。消毒剂测试浓度宜选取参考敏感菌株1/4MIC、1/2MIC、MIC、2MIC、4MIC，常见含氯消毒剂的参考敏感菌株MIC值见附录B。5仪器与设备开展细菌抗性评价的微生物实验室应符合GB19489生物安全二级实验室（BSL-2）要求，除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：5.1微量移液器：0.1μL～2.5μL；0.5μL～10μL；10μL～100μL；100μL～1000μL。5.2多通道微量加样器：1μL～100μL。5.3麦氏比浊管或浊度仪：麦氏浊度0.01～4.00。5.4通风橱。5.5酶标仪。5.6涡旋震荡仪。5.7恒温水浴锅：46℃。5.8恒温培养箱：37℃。6评价方法6.1接种物制备无菌操作将测试菌株以及参考敏感菌株在TSA平板上划线，36℃培养16h-18h，用无菌棉签蘸取3个-5个单菌落，在含有3mL生理盐水的灭菌离心管中充分漩涡震荡，用浊度仪或标准比浊管调整菌液浓度至0.5麦氏单位，再使用MHB将菌悬液稀释100倍后混匀备用。调制好浓度的菌液应在15min内完成加样。6.2接种室温条件下，在96孔酶标板中加入50μL含不同浓度消毒剂工作液；按照由低到高的消毒剂浓度依次接种50μL稀释后的菌悬浮液；使用酶标板一次性封口膜将其密封，在36℃下培养18h，试验应同时设置阳性对照（接种50μL参考敏感菌悬液和50μL空白MHB）和阴性对照（直接接种100μL空白MHB），每个样品设置3个重复。T/ZNZ338—202537结果判定利用酶标仪进行细菌浓度检测，以96孔板中未检测到测试株可见生长（OD600<0.1）的最低消毒剂浓度作为MIC值；若测试株MIC值大于参考敏感株MIC值，则判断菌株具有抗性，反之为敏感。第二法琼脂平板法8评价方法8.1接种物制备8.2琼脂平板制备灭菌后的MHA培养基放置于恒温水浴箱降温至46℃,每瓶培养基加入1/9体积不同浓度含氯消毒剂工作液，充分混匀后倾倒入直径为90mm无菌平皿，每个浓度做3个平行。8.3接种室温条件下，用移液枪将配置好的菌液接种到含不同浓度消毒剂的琼脂平板表面，每个样点的接种量为5μL，室温下静置10min，转移至37℃恒温培养箱孵育约18h。以未添加消毒剂的琼脂平板作为阳性对照。9结果判定通过肉眼判断琼脂平板上是否有菌落长出，以抑制细菌生长的最低消毒剂浓度为测试株的MIC值。若测试株MIC值大于参考敏感株MIC值，则判断菌株具有抗性，反之为敏感。T/ZNZ338—20254（资料性）培养基A.1Mueller-HintonBroth肉汤（MHB）A.1.1成分MHB肉汤成分见表A.1。表A.1MHB成分A.1.2制备称取各成分加蒸馏水定容至1000mL，调节pH至7.1±0.2，121℃高压灭菌15min。A.2胰酪胨大豆琼脂（TSAAgar）TSA琼脂成分见表A.2。A.2.1成分表A.2TSA成分A.2.2制备除琼脂外，称取各成分加蒸馏水定容至1000mL，调节pH至7.1±0.2，再加入琼脂，121℃高压灭菌15min，倾注平板。A.3Mueller-Hinton琼脂（MHA）A.3.1成分T/ZNZ338—20255MHA琼脂成分见表A.3。表A.3MHA成分