CN115851635B 一种s-尼古丁的制备方法 （深圳瑞德林生物技术有限公司）

202110914222.42021.08.10道麻岭社区高新中一道10号深圳生物在尼古丁合成酶催化下将该亚胺与烟酸缩合脱的同时也使得其更符合当今绿色工业生产的需2所述亚磷酸脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO:所述尼古丁合成酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO:所述胺氧化酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO:所述胺氧化酶突变体、尼古丁合成酶突变体、亚磷酸脱氢酶突变体所述溶剂为三羟甲基氨基甲烷盐酸或含助溶剂的三羟甲基氨所述β烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸单钠盐的浓度为0.3用到剧毒(NaCN等),易爆(RaneyNi氢化)等复杂危险生产工艺。(参考文献：国际专利4[0016]与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示氨基酸序列至少有90％同源性且功能与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2[0017]本发明中，胺氧化酶突变体1(AO1)与胺氧化酶突变体2(AO2)均来源于黑曲霉(Aspergillusniger)体内的一个单胺基氧化酶，该野生型酶的氨基酸序列号为：UniprotID:P46882,EC1[0021]一些实施方案中，编码所述的氧化酶突变体的核苷酸序列如SEQIDNO:3或SEQ氧化酶突变体2(AO2)的核苷酸序列如SEQIDNO:[0025]与SEQIDNO:5所示氨基酸序列至少有90％同源性且功能与SEQIDNO:5相同或相[0027]一些实施方案中，所述尼古丁合成酶突变体包含14个位点突变：M17H,R112T,Q113F,L162A,Q180E,F183A,S212K,A229P,P248L,V254R,A261H,K341V,R346T,G394T，其氨5[0029]一些实施方案中，编码所述的尼古丁合成酶突变体的核苷酸序列如SEQIDNO:6[0033]与SEQIDNO:7所示氨基酸序列至少有90％同源性且功能与SEQIDNO:7相同或相[0035]一些实施方案中，所述亚磷酸脱氢酶突变体包含13个位点突变：V71I,Q132R,E130K,Q137R,I150F,A176R,Q215L,R275Q,L276Q,I313L,V315A,A319E,A325V，其氨基酸序[0037]一些实施方案中，编码所述亚磷酸脱氢酶突变体的核苷酸序列如SEQIDNO:8所6氧化成对应的亚胺，然后再尼古丁合成酶或其突变体催化下将所述亚胺与烟酸缩合脱羧，[0064]将所述反应体系于1.0～2.0大气压的氧气压力下25～35℃缓慢搅拌反应4～8小7产成本的同时也使得其更符合当今绿色工业NS突变体(SEQIDNO:5)以及亚磷酸氧化酶PTDH突变体(SEQIDNO:7)均由本发明通过构[0082]首先合成以上酶突变体酶所对应的基因(由安徽通用生物合成),再以NdeI/XhoI入5L培养发酵罐里进行培养；当细胞OD～15加入0.5mM异丙基一β一D一硫代吡后利用冻融法破碎细胞，高速离心后上清液利用十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳匀(10克湿细胞与约200ml缓冲液混合)，然后进行高压破碎细胞壁，高速离心(16000rpm,转化1μmol的底物所需酶量)或进一步纯化后固定化使用(固体酶反应时)。LB培养基构成8G25尺寸排阻色谱柱脱盐(购于Sigma)以及利用DEAESepliteFF(西安蓝晓公司)阴离子交换柱分离得到初纯化液体酶AO1、AO2、NS、PTDH。最后AO1/AO2、NS、PTDH以及诺维信的Catalase利用LX一1000EP环氧树脂(西安蓝晓公司)按照活性单位2:4:6:1进行一次性混合[0087]在1L50mMpH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(T[0088]随后将反应液转入耐压反应器中维持1.5大气压的氧气压力下30℃缓慢搅拌反应pH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶[0091]随后将所述反应液转入耐压反应器中维持1.5大气压的氧气压力下30℃搅拌反应烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)单钠盐(0.2mM),26克五水亚磷酸钠(120mM)以及100ml9[0094]随后将所述反应液转入耐压反应器中维持1.5大气压的氧气压力下30℃轻微震荡反应12小时，待反应完成后过滤回收固定化复合酶(固定化酶用[0096]和实施例(2)类似在1L50mMpH8.0的三羟甲基氨基甲[0097]随后将所述反应液转入耐压反应器中维持1.5大气压的氧气压力下30℃搅拌反应[0099]与上述实施例1类似在1L50mMpH8.0的三羟甲基氨苷酸磷酸(NADP+)单钠盐(0.4mM),26克五水亚磷酸钠(120mM)以及100ml