第三章基因工程第一节基因工程工具酶

第三章基因工程第一节基因工程工具酶(一)、限制修饰系统得种类1、

I型:由三个基因构成,hsdR;hsdM;hsdS(hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity)位于染色体上,三个基因构成一个复合体,限制酶需要ATP、Mg2+、SAM(５—腺苷甲硫氨酸),无特异切割位点。2、

II型:限制与修饰基因产物独立起作用,在Ｅ、coli中这两种基因位于质粒上。3、

III型:修饰酶与Ｉ型酶相同,hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成一亚单位,限制酶就是独立存在得。

上述三个系统中,只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高得核苷酸识别特异性,因而被广泛用于基因工程中。(二)、限制性内切酶得定义、命名

1、定义:广义指上述三个系统中得限制酶;狭义指II型限制酶。

2、命名:限制酶由三部分构成,即菌种名、菌系编号、分离顺序。例如:HindⅢ前三个字母来自于菌种名称H、influenzae,“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型;“Ⅲ”表示分离到得第三个限制酶。EcoRI—EscherichiacoliRIHindⅢ—Haemophilus

influensaedⅢSacI(II)—Streptomyces

achromagenesI(Ⅱ)(三)、限制酶得特点

1、识别顺序与酶切位点１)识别４-8个相连得核苷酸

MboINGATCN;AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC:PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC;

SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGGFokI5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’

外侧,产生５’-端突起２)富含ＧＣ

３)对称性—双对称

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

４)切点大多数在识别顺序之内,也有例外５)限制酶切后产生两个末端,末端结构就是５’-Ｐ与３’-ＯＨ

2、

末端种类

１)３’-端突起,个数为２或４个核苷酸

PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’

２)５’-端突起,个数为２或４个核苷酸

EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GOH

PAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAP

HOG-5’

粘性末端能与另一个相同得粘连末端相连接,任何两个具有相同识别位点得DNA分子经限制酶切割后能够重新连接成新得重组DNA分子。在进行DNA重组时,应用限制酶同时切割目得基因与载体DNA,使之产生相对得粘性末端,然后再将二者连接成重组DNA分子

３)

平齐末端

SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’

４)非互补得粘性末端ａ)切点在识别顺序之外得,如:FokIFokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13

ｂ)能识别简并顺序得,如:AvaI

AvaI

5’-CPyCGPuG-3’

CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG

5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’5’-GTTAAC-3’3’-CAATTG-5’EcoRⅠ得识别序列HaeⅠ得识别序列5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG3’NNNNNCTTAApEcoRⅠ得识别序列与酶切切口(粘端)pAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’

5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘

3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘5’NNNNNGTTpAACNNNNN3’3‘NNNNNCAApTTGNNNNN5’HaeⅠ得识别序列与酶切切口(平端)酶切条件:酶切缓冲液低盐组:0～50mmol/LNaCl中盐组:50～100mmol/LNaCl高盐组:100～150mmol/LNaCl(四)、异源同序酶(isoschizomer,同裂酶)1、定义:能识别相同序列但来源不同得两种或多种限制酶

2、特点:1)识别相同顺序

2)切割位点得异同

KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG

大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静(五)、限制酶得用途

1、

DNA重组

2、

限制酶(物理)图谱绘制

3、

突变分析(RFLP分析)

4、限制酶得部分酶切与完全酶切附:IIS型限制酶得特点

1、

具有特异型核苷酸顺序识别能力,但该顺序不具有对称结构。

2、

酶切位点与识别位点不一致,切点常在识别位点得一侧,1--20nt。

3、

酶切后得末端经补平后又可发生酶切反应。

4、

产生粘性末端可以就是1--5个核苷酸。

5、

均为单体,分子量为47—108kD。酶切图谱得构建(a)请构建该环状DNA分子得酶切图谱酶切图谱得构建(b)二、DNA甲基化酶

(一)、甲基化酶得种类与识别顺序1、

限制修饰系统I、II、III型中得甲基化酶三个系统中得甲基化酶可使细菌DNA分子中得胞嘧啶与腺嘌呤发生甲基化,形成5’-甲基胞嘧啶与6’-甲基腺嘌呤。在DNA重组实验中,常用得甲基化酶属于II型,它与相应得限制酶得识别顺序相同,其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。如:M、EcoRIGAmATTCCEcoRIGAATTC不同

M、HpaICmCGGHpaICCGG相同2、

II型甲基化酶对限制酶活性得影响

１)

抑制同种限制酶得活性

M、BamHIGGATmCC—BamHI(G

GATCC)M、EcoRIGAmATTC—EcoRI(G

AATTC)

２)

抑制不同种限制酶得活性

a、顺序完全重叠如:M、ClaI(ATCGmAT)----TaqI(TCGmA)

b、顺序边界重叠如:M、BamHI(GGATmCC)----MepI(mCCGG)

３)

抑制不同种限制酶得部分活性

M、TaqI(TCGmA)---HindII(GTPyPuAC):GTCAAC,GTTAAC,GTCGmAC,GTTGAC3、

甲基化酶得用途

１)

改变某些限制酶识别顺序得特异性,以便重组体得形成２)

在建立基因文库时,可先使DNA分子部分甲基化,然后再用限制酶切M.RECH3CH3CH3RERERERERERERERERERERECH3CH3CH3与载体相连甲基化酶人工接头RE用于基因组文库的建立用于cDNA的连接RERERE三、核酸酶

(一)、外切酶III(ExoIII)

1、一般特点:

来自于E、coli,分子量28,000kD

2、催化反应类型

1)外切酶活性:3’→5’,产生5’-单磷酸核苷酸与具各种结构得ds-DNA,pH7、6-8、52)核酸酶H活性:除去DNA-RNA杂交分子中得RNA分子,pH7、6-8、53)3’-磷酸酶活性:除去3’-磷酸基后形成3’-OH端,有利于DNA聚合酶反应,pH6、8-7、44)内切酶活性:在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切开,pH7、6-8、53、

外切酶活性特点

1)反应底物:互补ds-DNA2)碱基释放速度:C>>A-T>>G3)反应产物:5’-单磷酸核苷与具缺口或5’-端突起得ds-DNA,过度反应将导致DNA降解

4、

用途

1)

核酸(DNA)标记

2)

基因突变----缺失

3)

DNA序列测定时作顺序缺失

5、

使用注意事项

1)

正式使用前,测定在一定条件下酶得反应速度

2)

在一定条件下,ExoIII不能作用GC富集区(来自于cDNA加尾)ds-DNA结构:切口,缺口,断口缺口(gap)切口(nick)断口(cut)3'HOP5'3'HOP5'5'P5'P5'P5'P5'P3'HO3'HO3'HO3'HO3'HO3'HO3'HO3'HOOH3'OH3'OH3'OH3'P5'P5'P5'P5'P5'P5'P5'3'HOP5'OH3'P5'RNaseHExoIII得外切酶与RNaseH得作用1234abc1234abc1234abc1234abc1234abc234abc34abc4abcabcExoIII用于顺序缺失ExoIII

ExoIII

[α-32P]

[α-32P]

dCTP

dCTP

5'PP5'5'PP5'3'HOOH3'3'HOOH3'ExoIII用于DNA标记(二)、RNase(三)、RNaseH(二)、RNase

大部分用于RNA得核苷酸序列分析或除去DNA样品或蛋白质合成系统中得RNA分子。

1、RNaseA分离自牛胰脏,对热稳定,抗去污剂(100℃加热15min仍具活性),用于除去DNA样品中得RNA分子

2、核酸酶S7,亦称微球菌核酸酶,对RNA敏感,用于除去蛋白质合成系统中得内源mRNA

(三)、RNaseH

作用于DNA-RNA杂交分子中得RNA链,用于cDNA文库建立时除去RNA链以便第二条链cDNA链得合成。

(四)、DNaseI1、特点:具内切酶活性,作用于ds-DNA,但无核苷酸序列特异型,产生5’-P低聚核苷酸;Ca2+,Mg2+

或Ca2+,Mn2+可使酶活达最大值当酶浓度很低时,ds-DNA分子上将形成切口,不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响:Mg2+存在时,两条链上得切口独立无关,Mn2+存在时,两条链上得切口几乎在同一位置

2、用途

1)切口移位,制备DNA探针

2)制备RNA样品时除去DNA分子

3)基因突变时产生切口

Mn++存在时

Mg++存在时

DNaseI作用特点DNaseIHOP5’3’5’3’5’3’DNaseI与PolI的切口移位PolI四、聚合酶包括DNA聚合酶与RNA聚合酶(一)、E、coliDNA聚合酶I(polI)

1、E、coli

得DNA聚合酶系统

PolI参与DNA修复,具3’→5’与5’→3’外切酶活性

polII同上具3’→5’外切酶活性

polIII参与DNA复制,具3’→5’与5’→3’外切酶活性

2、E、colipolI得特点

1)具两种外切酶活性与DNA聚合酶活性,在蛋白酶作用下,该酶分裂成两个大小不同得片段,其中小片段具5’→3’外切酶活性,大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦称为Klenow片段,polIK)2)聚合酶活性,5’→3’,要求3’-OH引物与模板DNA,其延续性受反应条件得影响

3)外切酶活性

3、用途

1)除去3’-端突起得单链DNA(在无dNTP时)

2)补齐5’-突起端

3)合成第二条cDNA4)切口移位制备探针其中用途2)与3)常用大片段(二)、T4DNA聚合酶

1、特点:

5’→3’聚合酶活性,1500nt/min,为polI得两倍3’→5’外切酶活性,可作用于ss-DNA与dsDNA,其切除速度分别为40与4000nt/min,缺少5’到3’得外切核酸酶活性、

2、

用途:

制备高比活性探针(1010cpm/μgDNA);DNA末端修饰---缺失

外切酶活性

聚合酶活性

无dNTPdNTP(三)T7噬菌体DNA聚合酶具3’到5’端外切核酸酶活性与持续合成能力较低得DNA聚合酶活性、应用:1)合成DNA能力很强,可用于延伸很长得模板、2)可用于定点诱变中互补链得合成、3)3’末端得标记4)将双链DNA得黏性末端转变为平端、(四)、TaqDNA聚合酶1、特点:

分离自水生栖热菌,分子量为94,000,最适反应温度75℃,对95℃高温具良好稳定性,该酶不存在3’→5’外切酶活性2、用途:

主要用于DNA得体外扩增,经25次循环后才进入酶得反应稳定期,一个DNA分子因而可被扩增4×106倍。

DNA扩增技术又称为聚合酶链式反应,它包括以下三个步骤:

DNA模板变性(95℃)→与DNA引物退火