CN116622006B 短效的基于肝素的抗凝血剂化合物和方法 （北卡罗来纳大学查珀尔希尔分校）

201880020095.X2018.03.12US2016122446A1,2016.05.05SulfatedHeparinOctasaccType1.Biochemistry.2008,第4HomogeneousUltralowMolecularWe本发明涉及短效的基于肝素的抗凝血剂化径。提供了治疗需要抗凝血活性的受试者的方2至少一个IdoA2S_GlcNS3S或IdoA2S_GlcNS3S6S二糖单元；并且3.根据权利要求1所述的合成肝素类似物，其中所述合成肝素类似物对抗凝血酶具有4.根据权利要求1所述的合成肝素类似物，其中所述合成肝素类似物具有10ngmL_1至5.根据权利要求1至4中任一项所述的合成6.根据权利要求1至4中任一项所述的合成肝素类7.根据权利要求1至4中任一项所述的合成8.根据权利要求1至4中任一项所述的合成肝素类似物，其中在20μg/mL或更少的使用3_O_磺基转移酶(3_OST)的3_OST_3同种型进行至少10.根据权利要求9所述的方法，其中所述合成肝素类似物包含至少一个IdoA2S_311.根据权利要求9所述的方法，其中所OST_3的3_O_硫酸化发生于所述6_O_硫酸化步骤之13.根据权利要求12所述的方法，其中所述糖基转移酶选自由大肠杆菌(E.coli)K5的N_乙酰基葡糖胺基转移酶(KfiA)和/或来自多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)的成的组中的单糖：葡糖醛酸(GlcUA)，N_乙酰化葡糖胺(GlcNAc)和N_三氟乙酰基葡糖胺成肝素类似物对抗凝血酶具有5nM至30成肝素类似物具有10ngmL_1至40ngmL_1I20.一种通过权利要求9至16中任一项所述的21.一种通过权利要求9所述的方法生产的合成22.一种通过权利要求9所述的方法生产的合成23.一种通过权利要求9所述的方法生产的合成24.一种通过权利要求9所述的方法生产的合成肝素类似物，其中在20μg/mL或更少的425.一种包含权利要求1至4中任一项所述的5[0001]本申请是申请日为2018年3月12日的题为“短效的基于肝素的抗凝血剂化合物和[0003]本申请要求享有2017年3月10日提交的美国临时专利申请序列号62/469,643的权[0005]本发明是在国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)资助的项目号题涉及具有短效抗凝血剂活性(shortactinganticoagulantactivity)的肝素化合物和(EskoandSelleck(2002)Annu.Rev.Biochem.71,435_471；LiuandThorp(2002)荷的多糖，其包含1→4_连接的葡糖胺和葡糖醛酸/艾杜糖醛酸单元(含有N_和O_磺基两者)。HS内独特的糖序列能够决定HS与其靶蛋白结合的特异性(Linhardt(2003)用于合成肝素化合物和HS的新方法引起了开发具有改进的药理学作用的抗凝血剂和其他成ULMW肝素五糖ARIXTRA8(MW1508.3Da)。UF肝素由于其相对较短的半衰期和对肾功能受损患者的安全性而用于手术和肾透析(H6一个被3_OST_3酶硫酸化的二糖单元和至少一个IdoA2S_GlcNS3S或IdoA2S_GlcNS3S6S二糖[0012]在一些方面中，本文提供的所述合成肝素类似物能够含有至少一个IdoA2S_肝素类似物在20μg/mL或更少的andexanet_α存在下能够以50％或更高的速率被IdoA2S_GlcNS3S±6S二糖单元，其中所述方法还包括使用6_O_磺基转移酶(6_OST)的6_O_所述糖底物包含GlcA_GlcNS3S6S二糖单元，其中所述方法还包括使用6_O_磺基转移酶(6_糖基转移酶选自由大肠杆菌K5的N_乙酰基葡糖胺基转移酶(KfiA)和/或来自多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)的肝素合酶(heparosansynthase)_2(pmHS2)组成的所述组似物包含至少一个通过3_OST_3酶硫酸化的二糖单元和至少一个IdoA2S_GlcNS3S或78[0022]因此，本发明公开的所述主题的目的是提供短效的基于肝素的抗凝血剂化合物(short_actingheparin_basedanticoagulantcompound)和方法，包括新形式的合成肝的附图标记在不同视图中表示相应的部件。通过参考所述附图的图示中阐述的实施方式，作方法(通常与其进一步的目标和优点一起)。所述附图并非旨在限制本公开主题的范围[0027]图2A是高分辨阴离子交换HPLC的结果的图示，而图2B显示了对化合物6进行的证明本文公开的寡糖的纯度和结构分析的电喷雾电离质谱(electrosprayionizationmass[0028]图3A～图3D是图示说明GlcNS3S6S_IdoA2S_二糖单元的存在对抗凝血活性的影响9[0029]图4A是所述AT_结合位点的化学结构的示意图，而图4B图示描述了复合物中AT的[0030]图5A～图5C图示说明了使用不同尺寸的结构均匀性寡糖对于3_OST_1和3_OST_3的底物要求，其中图5A和图5B是显示对于3_OST_1和3_OST_3的底物要求的柱状图(bar[0032]图7A是证实本文公开的肝素化合物在C57BL/6J小鼠模型中具有比磺达肝素(fondaparinux)更快的清除率的数据的图示汇总。图7B是证实本文公开的肝素化合物的抗_Fxa活性能够被andexanet_α(PortolaPharmaceuticals,SouthSan显示所述7_链节具有抗_Xa活性的数据的图示汇总，图8B示意性地将所述7_链节的化学结[0035]葡糖胺的3_OH位置的硫酸化是形成硫酸乙酰肝素的结构域使之能够实现其生物学功能的至少一种重要修饰。人类基因组中的7种3_O_磺基转移酶同种型涉及3_O_硫酸化O_磺基转移酶3的底物特异性而实现。3_O_硫酸化对2_O_硫酸化艾杜糖醛酸的吡喃糖环构象的影响使用NMR进行了研究，并研究了3_O_硫酸化对环构象与抗凝血剂活性之间的相关[0036]硫酸乙酰肝素(HS)是包含与葡糖胺(GlcN)残基连接的葡糖醛酸(GlcA)或艾杜糖[0037]HS和肝素的功能选择性能够至少部分由所述硫酸化类型和GlcA和IdoA残基的位置决定5GlcA2S和GlcN残基的构象存在于所述椅式(4C1)构象中7,8。IdoA2S残基的构象灵活性允许与抗凝血酶结合从而表现出抗凝血活性9以及允许与成纤维细胞生长因子结合从而调节细关。3_O_硫酸化对于抗凝血活性可能很重要19，促进单纯疱疹病毒进入宿主细胞以建立感O_硫酸化葡糖胺(GlcNS3S±6S)残基如何在促进HS的生物活性中发挥作用目前尚不清楚。成包含所述_IdoA2S_GlcNS3S_或_IdoA2S_GlcNS3S6S_二糖单元的寡糖，所述3_OST_3修饰述_GlcA_GlcNS3S6S_二糖单元。来自所述四糖底物的3_OST_3与6_O_磺基之间没有相互作七糖底物的3_OST_1和6_O_磺基之间却观察到相互作用，这表明需要6_O_硫酸化以结合至由不同同种型的3_OST修饰的3_O_硫酸化HS通过不同途径进行生此34,35OST_1酶修饰的产物33,39。基于由所公开的方法开发的寡糖并且是3_OST_3酶修饰产物会与[0042]本文还公开了的发现是一些开发的HS化合物或寡糖具有出乎意料的快速清除这些化合物的快速清除提供了一种具有降低出血风险的潜在新型短效抗凝血药物候选药类似物具有抗凝血活性，包括对抗凝血酶的结合亲和力(约5nM～约30nM)和抗Xa活性(约5的清除率比磺达肝素的清除速率快至少约5075％或100或约50约100约60约90约70约80约50约75或约75约100％。这种快速清除能够使这些化合物适合作为短效抗凝血化合物，其特别适用于具有较高出血风险的应用和/或长度的糖类，使用3_O_磺基转移酶(3_OST)酶的3_OST_3同种型进行至少一次硫酸化反应，[0046]所公开的合成肝素类似物的合成方法能够提供令人惊讶的高产率的肝素化合作为实例而非限制，所公开的合成肝素类似物的合成方法能够具有大于约20大于约30大于约40大于约50约20约50约30约50或约40约50％的产3_OST_1的3_O_硫酸化发生于6_O[0048]本公开的肝素化合物和合成肝素类似物的开发还提供了使用其治疗受试者的治素类似物，其中所述合成肝素类似物包含至少一个被3_OST_3酶硫酸化的二糖单元和至少率通过andexanet_α(PortolaPharmaceuticals,SouthSanFrancisco,予具有抗凝血活性的合成肝素类似物，其中所述合成肝素类似物包含至少一个被3_OST_3酶硫酸化的二糖单元和至少一个IdoA2S_GlcNS3S或IdoA2S_GlcNS3S6S二中所述合成肝素类似物包含至少一个被3_OST_3酶硫酸化的二糖单元和至少一个IdoA2S_或病症。作为示例而非限制，此类疾病或病症能够包括患有深静脉血栓形成(deepvein用途，其中所述合成肝素类似物包含至少一个被3_OST_3酶硫酸化的二糖单元和至少一个IdoA2S_GlcNS3S或IdoA2S_GlcNS3S6S二糖单元，用于制备用于治疗和/或预防其中抗凝血32CH3或类似于对硝基苯基的其他取涵盖所述指定量的±0.5％的变化，和在一些实施方式中涵盖所述指定量的±0.1％的变了这三个术语之一)，本公开和要求保护的主题能够包括所述其他两个术语中的任一个的支链或1-8烷1-8支链烷基。团每个能够在所述环结构的一个或多个可用碳原子上被取代。所述R基团的存在或不存在以及R基团的数量由所述整数n的值确定。每个R基团(如果不止一个)在所述环结构的可用环环烷基环包括金刚烷基、八氢萘基、十氢化萘(decalin)、樟脑、莰烷和正金刚烷基子是氮原子的杂环。N一杂环的实例包括，但不限于，氮杂环丁烷(azetidine)、吡咯烷的是，所公开的主题的原理表明所述组合物和方法对无脊椎动物和对所有脊椎动物物种，[0094]更具体而言，本文提供了对诸如人类的哺乳动物以及以下那些哺乳动物的测试、类具有经济重要性(在农场饲养以供人类消费的动物)和/或社会重要性(作为宠物或在动物园中饲养的动物)的那些哺乳动物，例如，除了人类以外的食肉动物(如猫和狗)，猪[0095]在一些实施方式中，根据本公开的主题使用的受试者是需要对其治疗和/或诊断[0101]本公开主题的所述组合物的给药能够通过本领域普通技术人员已知的任何方法[0104]本公开主题的组合物中的活性成分的实际剂量水平能够进行变化从而给予有效公开的具体实施方式中作出许多改变并仍然获得相同或相[0110]使用Sf_900TMIIISFM(LifeTec6_O_磺基转移酶1(6_OST_1)和6_O_磺基转移酶3(6_OST_3)的表达。浓度为2.0×106个细胞/mL的昆虫细胞通过表达小鼠6_OST_1和人6_OST_3的重组病毒进行感染，并使其在振荡器中于27℃孵育96小时。所述培养溶液以4,000RPM离心10min而造粒沉淀(pellet)所述细胞。然后将含有1mM苯基甲磺酰氟(PMSF，100mM原溶液(stocksolution)新制于95％乙醇滤。然后将所得培养基与等体积的含有0.05％Triton_100和2％甘油的40mM3_(N_吗啉基)丙磺酸(MOPS)缓冲液(pH7.0)混合。使用肝素Toyopearl凝胶(HeparinToyopearlgel)(TosohBioscience)柱采用以下两种[0111]使用BL21细胞在大肠杆菌中进行3_OST_1和3_OST_3的表达。对于3_OST_1和3_OST_3，所述转化的细胞在含有50μg/L卡那霉素的LB培养基中生长，并在37℃孵育直至获所述细菌细胞。将所述细胞再悬浮于25mL含有25mMTris(pH7.5)、30mM咪唑和500mM[0113]化合物1～3的合成由称之为“NS2S6_链节底物”的六糖(GlcNS_GlcA_GlcNS_来自TosohBioscience))而监测所述反应的完成。如果反应完成<60则加入另外的3_所述反应混合物进行Q_Sepharose色谱(100mMMOPS(pH7.0)和1mL的6_OST_1和6_OST_3的酶混合物的总体积为100mL的缓冲液中37℃孵育过夜。通过向阴离子交换HPLC中注入少量所述反应混合物而监测所述反应的完[0115]为了合成化合物4～6，使用称为NS2S8_链节底物的八糖(GlcNS_GlcA_GlcNS_述底物与2mMPAPS在含有33mMMOPS(pH7.0)、10mMMnCl2、5mMMgCl2和4mL3_OST_3少量所述反应混合物注入阴离子交换HPLC而监测所述反应的完成。如果所述反应完成<60则加入另外的3_OST_3酶和PAPS，并将所述反应混合物在37℃下保持另外18～24小100mMMOPS(pH7.0)和3mL6_OST_1和6_OST_3混合物的总体积为100mL的缓冲液中37℃孵[0118]为了确定3_OST_1和3_OST_3的所述底物要求，使用了不同尺寸的结构均一的寡硫酸化的、2_O_硫酸化的和6_O_硫酸化的6_链节～12_链节(6_链节2S6S～12_链节2S6S)。L3_OST_1或3_OST_3和30μM与[35S]PAPS((1～3)×105cpm)混合的PAPS的100μL反应缓冲液中37℃孵育1h。向所述反应混合物中加[0120]所述酶动力学通过孵育30μL对于具有N_硫酸化和2_O_硫酸化的寡糖的纯化3_进行表征。将PAPS(120μM)与1×105cpm作为硫酸盐供体的[35S]PAPS和0～200μM的不同浓度的寡糖在37℃下混合1h。所述反应物加载至DEAE柱上从而纯化所述35S_标记寡糖产物。35S_标记寡糖产物的量相对于底物浓度作图，然后使用SigmaPlot软件对Michalis_Menten曲线图进行曲线拟合从而获得Km和Vm[0124]采用TSKgelDNA_NPR_柱检测所述反应的完成程度和在纯化后的合成寡糖纯度。[0126]通过ESI_MS(ThermoLCQ_Deca)测定合成寡糖的分子量构象(conformation)。[0128]为了合成3_O_[34S]硫酸化化合物4，将所述底物NS2S8_链节(2mg)与3_OST_3酶3_OST_3的总体积为20mL的缓冲液中孵育。所述反应混合物在37℃下孵育过夜。使用Q_[0130]所述串联质谱分析(tandemmassspectraanalysis)在ThermoLTQ_FT仪上按照[0132]NMR实验在298K下在带有Topsin3.2软件的BrukerAvance700MHz和850MHz光谱干三次以除去可交换的质子。所述样品重新溶解于0.5mLD2O中并转移到NMR微管(O.D.5mm，Norrell)中。化学位移参照外部2,2_二甲基_2_硅杂戊烷_5_磺酸钠盐(DSS，行记录。使用48次虚拟扫描(dummyscan)之后才开始采集。在f2中收集了2048个全部点[0134]使用所述AT_五糖复合物(PDBID：3EVJ)的现有晶体结构作为所述系统的起始结所述TIP3P水模型在所述复合物周围12A的截短八面体盒中进行溶剂化。拟需要对IdoA2S残基d(图4A)进行内部都受到约束。随后，去除对所述蛋白的配体和侧链的约束。静电相互作用采用Particle_[0138]使用所述MPBSA.py.MPI模块52，采用单轨迹分子力学_广义生成溶剂可及表面积(single_trajectoryMolecularMechanics–GeneralizedBornSolventAccessible除所有水分子和离子，并通过所述GB隐式溶剂化模型(GBimplicitsolvationmodel)(igb＝2)58近似去溶剂化能量的贡献。所述模拟分成5ns箱(bin)和由每个箱内均匀分布的100个快照(snapshot)的全体(ensemble)计算的平均相互作用能量贡献。采用GraphPad[0140]用含有1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)的PBS将因子Xa(EnzymeResearch[0142]所有研究均在北卡罗来纳大学的研究所动物护理和使用委员会(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)(IACUC抽股动脉/隐静脉(contralateralfemoral/saphenousvein)中抽取0.8mL血液至150mM柠檬[0144]使用针对每种化合物生成的校准曲线，对于每个相应的FXa活性百分比读出所述反应混合物中的化合物浓度。对每个时间点计算出平均血浆浓度和每组所述4只大鼠之间用两种3_O_磺基转移酶(3_OST)同种型(3_OST_1和3_OST_3)将GlcNS3S±6S残基安装于不GlcNS3S残基，其在所述非还原末端与IdoA2S残基连接，形成_IdoA2S_GlcNS3S_的二糖单含所述_IdoA2S_GlcNS3S_二糖单元的寡[0148]本文公开了3_OST_3和3_OST_1具有不同底物要求的发现。所述3_OST_1酶硫酸化携带6_O_硫酸化的寡糖底物，同时对无6_O_硫酸化的寡糖底物表现出非常低的反应性(图酸化的寡糖(图5A和图5B)，但这些6_O_硫酸化寡糖图6C和图6F所示)。所述AT结合结构域包含_GlcNS(或Ac)6S_GlcA_GlcNS3S±6S_IdoA2S_[0154]对化合物1～6进行纯度和结构分析，分析图6E中所示的化合物6的代表性数据如其非常接近计算分子量2448.92(图2B)。化合物6的所述1H_NMR谱清楚地显示出8个异头质析也有助于定位化合物5和6中的所述IdoA2S_GlcNS3S糖(化合物7)中的所述IdoA2S残基的那些，所述3_O_硫酸化增个IdoA2S残基，称为残基c和e。3_O_硫酸化对所述2SO群体的影响是不同的。例如，与无加了所述相邻IdoA2S残基(残基e)的2SO群体，但与化合物10中的相应残基相比，对远端些观察表明3_O_硫酸化能够通过其对IdoA2S残基构象的影响而调节HS的结构。化合物在所述IdoA2S残基的位置上是不同的。在化合物8中，所述3一O一硫酸化葡糖胺(GlcNS3S6S)残基在所述还原端上侧接IdoA2S残基，从而使其具有所述一GlcNS3S6S一具有所述GlcNS3S6SGlcA二糖单的所述IdoA2S残基表现出所述2SO构象；而在化合物2中，该位置则被采用所述4C1构象的残基在所述复合物中以2SO构象存在31,32。其中所述IdoA2S残基被表现出2SO构象的IdoA残GlcAGlcNS3S±6S单元33。用HS中的所述IdoA2SGlcNS3S6S二糖单元取代GlcA8链节的AT结合分析显然挑战了这一论断。含所述IdoA2SGlcNS3S6S(但不是GlcA的所述AT结合亲和力分析也证实了化合物5紧密结合于AT(图3B和表3)。化合物6表现出抗FXa活性和高AT结合亲和力(表3)，因为该8链节含有所述GlcAGlcNS3S6S二糖单的现有共晶结构中的AT结合而言重要的部分验证所成包含所述_IdoA2S_GlcNS3S_或_IdoA2S_GlcNS3S6S_二糖单元的寡糖，所述3_OST_3改性产生所述_GlcA_GlcNS3S6S_二糖单元。该发现得到3_OST_1/七糖/PAP37和3_OST_3/四糖/物的6_O_磺基之间没有相互作用，这与3_OST_3的寡糖底物不需要6_O_硫酸化的结论是一要6_O_硫酸化以结合至3_OST_1。3_OST_1和3_OST_3之间的不同的且独特的底物要求提高了由3_OST不同的同种型改性的3_O_硫酸化HS通过不同路径进行生此34,35其是3_OST_1酶改性的产物33,39。尽管作为3_OST_3酶改性产物的化合物5不含所述_GlcA_[0174]化合物5的快速清除提供了具有降低的出血风险的潜在新型短效抗凝药物候选物5预期会具有非常低的HIT风险。3_O_硫酸化寡糖的可用性也为研究糖类硫酸化/构象与酶促方案以制备不同的3_O_硫酸化寡糖序列。该研究的结论将指导其他人使用不同3_OST323.2010,132,13132.R.Proc.Natl.Acad.Sci.200Hung,S._C.NatChem2011,3,557.