CN117487966B 一种寨卡病毒核酸检测试剂盒和检测方法 （湖北大学）

本发明公开了一种寨卡病毒核酸检测试剂序列如SEQIDNO.1～3所示的gDNAs以及序列如种新型的核酸检测系统，该系统基于PfAgo介导为10nM；而引入扩增步骤后，MDC可大幅降至果显示与qRT_PCR检测的一致性达到100这将有助于ZIKV感染的临床诊断和流行病学调查的2用于特异性扩增寨卡病毒NS5的扩增试剂，具体包括序列如SEQIDNO.10～11所示的3.根据权利要求2所述基于PfAgo的寨卡病4.根据权利要求2所述基于PfAgo的寨卡病毒检测方法，其特5.根据权利要求4所述基于PfAgo的寨卡病毒检6.根据权利要求2所述基于PfAgo的寨卡病毒检测方法，其特征在于，使用SEQIDNO.10～11所示的引物对待测样本进行PCR预7.根据权利要求2所述基于PfAgo的寨卡病毒3毒感染往往无症状或症状轻微，但在成人和儿童中罕见的会引起格林_巴利综合征等更严测方法具有极高的灵敏度和特异性，因此在寨卡病毒的检测验证中发挥了重要作用。促报告解锁)平台可以检测和区分患者样本中寨卡病毒和四种登革热病毒的血清型，浓度低至每微升1拷贝。但是，CRISPR/Cas系统依赖于原位杂交基序(protospacer_adja_cent[0007]本发明第一方面提供了一种基于PfAgo的寨卡病毒检测试剂盒，该检测试剂盒至4[0012]在本发明提供的检测试剂盒中，3个gDNAs是针对寨卡病毒基因组的非结构蛋白5[0022]本发明通过ZIKV_PAND与PCR预扩增联用的方法，可以检测到低至8.3aM经验丰富的操作人员，这可以降低检测的成本和复杂性。本发明的实验结果同时表明，ZIKV_PAND中的gDNA被证明只适用于检测寨卡病毒，而不会与DENV1基因组发生交叉反应，这意味着ZIKV_PAND具有更高的核酸诊断特异性。由于PfAgo可以区分不同的核苷酸突变5[0025]图3为实施例1中PfAgo介导的寨卡病毒核酸检测体系中向导DNA和分子信标的鉴[0035]以下实施例所用PfAgo具体为在大肠杆菌中表达的具有gDNA内切酶活性的His_PfAgo重组蛋白，其制备和纯化方式可参考文献(NovelNucleicAcidDetectionforHumanParvovirusB19BasedonPyrococcusfuriosusArgonauteProtein.Viruses2023,15,doi:10.3390/v15030595)，其中用Ni_NTA亲和纯化His_PfAgo重组蛋白的测定结MasterMix和Hieff_qPCRSYBRGreenMasterMix购自YeasonBiotech(上海，中国)，6[0040]进一步在MB的两端分别连接上荧光基团(FAM)和猝灭基团(BHQ1)得到分子信标f_涉及到的gMB_ZIKV及其对应的MB_ZIKV的序列信息具体如表1示的ZIKV_NS5_F/R通过PCR扩增获得)构建检测反应体系，具体为：将2pmol5’g_DNA、积为20μL的PfAgo反应缓冲液(20mMHEPESpH7.5、250mMNaCl和0.5m[0049]图5A为用SYBRGold染料染色(1_2号泳道)或直接用紫外光记录荧光图像(3_4号泳道)，对带有三种导向的ZIKV_PAND检测体系进行TBE_PAGE分析的结果，图中f_MB_ZIKVPfAgo的裂解活性是对照的34倍(图5B中左图)；使用蓝光透射荧光仪也能测出荧光强度的[0053]对于无需PCR的ZIKV_PAND灵敏检测，将ZIKVNS5目标PCR产物的序列量调整到7[0054]在利用PCR进行ZIKV_PAND灵敏性检测时，先确定寨卡病毒质粒(pUC_ZIKV，含有[0055]检测结果如图6所示，其中图6中左图为不经PCR的三种gDNA介导的ZIKV_PAND的检测到低至8.3aM(5.0copie[0060]为了证明本发明提供的ZIKV_PAND检测的特异性，本例首先通过比对ZIKV与DENV的基因序列，确定了DENV基因组中与ZIKVNS5靶标相似度最高的序列(见图7，具体如SEQ用ZIKV和DENV时，也没有观察到对寨卡病毒目标检测的显著影响。这些结果表明，ZIKV_[0063]由于寨卡病毒为RNA并不，本例分别利用了ZIKV_PAND系统和qRT_PCR对临床模拟样本进行了ZIKV核酸检测，具体方法为：首先分别构建了CMV启动子驱动的构建体ZIKV_EGFP(即含有如SEQIDNO.12所示的靶标序列)和DENV_EGFP(含有如SEQIDNO.15所示的[0064]结果表明：使用ZIKV_PAND结合PCR可以检测到含有ZIKV目标RNA但不含DENVRNA8PAND对临床模拟样本的诊断结果显示与q9