一维微流控微珠阵列芯片：核酸与蛋白激酶分析的创新应用与突破

一维微流控微珠阵列芯片：核酸与蛋白激酶分析的创新应用与突破一、引言1.1研究背景与意义在现代生命科学和医学研究中，对生物分子进行快速、准确、高灵敏度的分析检测至关重要。核酸作为遗传信息的携带者，其序列分析、基因表达水平检测以及基因突变的识别，对于疾病的早期诊断、发病机制研究和个性化治疗方案的制定具有关键作用。例如，在肿瘤研究领域，特定基因的突变或异常表达往往与肿瘤的发生、发展和转移密切相关，通过对这些核酸标志物的检测，可以实现肿瘤的早期预警和精准诊断。而蛋白激酶作为一类重要的酶，在细胞信号传导通路中扮演着核心角色，参与调控细胞的增殖、分化、凋亡等关键生理过程。蛋白激酶活性的异常变化与多种疾病，如癌症、心血管疾病、神经退行性疾病等的发生发展紧密相连。准确测定蛋白激酶的活性及其底物特异性，对于深入理解疾病的分子机制、发现潜在的药物靶点以及开发新型治疗策略具有不可或缺的意义。微流控技术作为一门新兴的交叉学科技术，融合了化学、流体物理、微电子、新材料、生物学和生物医学工程等多个领域的知识。它通过在微米尺度的微通道内对微量流体进行精确控制和操作，实现了生物、化学等实验室基本功能的微型化和集成化，具有分析速度快、样品和试剂消耗少、高通量并行分析、可实现自动化操作等显著优势。自20世纪90年代发展以来，微流控技术经历了从初期的原理探索到如今广泛应用于多个领域的快速发展过程。例如，在生物医学领域，微流控芯片已被用于疾病的诊断、药物筛选、细胞分析等多个方面；在环境监测领域，可用于对污染物的快速检测和分析。一维微流控微珠阵列芯片作为微流控技术的重要分支，有机地结合了微流控芯片技术、微阵列芯片技术和微珠非均相识别技术的优点。该芯片以微珠作为生物分子的载体，利用微流控通道实现微珠的精确操控和定位，构建成一维微珠阵列。微珠具有较大的比表面积，能够负载大量的生物探针，如核酸探针、抗体等，大大提高了检测的灵敏度和特异性。同时，一维微珠阵列的设计使得在单一微通道内可以实现多个生物样品的并行分析，极大地提高了分析效率，降低了检测成本。这种芯片在核酸和蛋白激酶分析中展现出了独特的优势和巨大的应用潜力，有望成为新一代的生物分子分析平台，为生命科学研究和临床诊断提供更加高效、准确的技术手段。1.2国内外研究现状在国外，微流控技术的研究起步较早，发展迅速。众多科研机构和高校在一维微流控微珠阵列芯片的研究方面取得了一系列重要成果。例如，美国的一些研究团队利用一维微流控微珠阵列芯片，通过设计特异性的核酸探针，成功实现了对多种病毒核酸的快速检测，包括流感病毒、乙肝病毒等，检测灵敏度达到了纳摩尔级别，大大缩短了检测时间，为传染病的快速诊断提供了新的技术途径。在蛋白激酶分析方面，欧洲的研究人员基于该芯片开发了一种新型的蛋白激酶活性检测方法，通过将蛋白激酶的底物固定在微珠表面，利用微流控芯片的流体操控特性，实现了对蛋白激酶活性的高通量检测，并且能够同时分析多种蛋白激酶的活性及其底物特异性，为药物研发过程中对蛋白激酶抑制剂的筛选提供了高效的技术平台。国内的科研团队也在这一领域积极开展研究，并取得了不少令人瞩目的成绩。一些研究小组通过优化微流控芯片的设计和制备工艺，提高了微珠阵列的稳定性和均一性，进而提升了芯片在核酸检测中的性能。例如，利用表面修饰技术对微珠表面进行功能化处理，增强了核酸探针与微珠的结合力，使得核酸检测的灵敏度和准确性得到了显著提高。在蛋白激酶分析方面，国内研究人员结合微流控芯片和荧光共振能量转移技术，实现了对蛋白激酶活性的高灵敏检测，并且将该技术应用于肿瘤细胞信号传导通路中关键蛋白激酶的研究，为肿瘤发病机制的深入探讨提供了有力的技术支持。然而，当前一维微流控微珠阵列芯片在核酸和蛋白激酶分析中的研究仍存在一些不足之处。在核酸检测方面，虽然检测灵敏度有了较大提升，但对于一些低丰度核酸的检测，仍然面临着灵敏度和特异性不够理想的问题，难以满足临床早期诊断的需求。此外，芯片的检测通量虽然较高，但在多目标核酸同时检测时，不同目标之间的交叉干扰问题尚未得到完全解决。在蛋白激酶分析中，现有的检测方法大多依赖于复杂的标记技术，操作繁琐，成本较高，限制了其在实际应用中的推广。同时，对于蛋白激酶在复杂生物样品中的活性检测，由于样品基质的干扰，检测的准确性和可靠性有待进一步提高。1.3研究目标与内容本研究旨在深入探究一维微流控微珠阵列芯片在核酸和蛋白激酶分析中的应用，通过优化芯片设计、改进检测方法，提高芯片在这两个领域的分析性能，解决当前研究中存在的问题。具体研究内容包括以下几个方面：基于一维微流控微珠阵列芯片的核酸检测方法优化：针对低丰度核酸检测灵敏度和特异性不足的问题，通过设计新型的核酸探针，如采用锁核酸（LNA）修饰的探针，提高探针与目标核酸的杂交亲和力；优化微珠表面的修饰方法，增强核酸探针在微珠表面的固定稳定性；同时，研究微流控芯片内的流体动力学特性，优化核酸杂交反应条件，减少非特异性吸附，从而提高核酸检测的灵敏度和特异性。多目标核酸同时检测中的交叉干扰消除策略研究：分析多目标核酸同时检测时交叉干扰产生的原因，从探针设计、反应条件优化以及信号检测等多个方面入手，提出有效的消除策略。例如，通过设计具有不同荧光发射波长的探针，利用光谱分辨技术实现对不同目标核酸的特异性检测；优化杂交反应的温度、时间和离子强度等条件，减少非特异性杂交；采用多重荧光检测技术结合数据处理算法，对检测信号进行准确解析，消除交叉干扰对检测结果的影响。基于一维微流控微珠阵列芯片的蛋白激酶无标记检测方法开发：为解决现有蛋白激酶检测方法依赖复杂标记技术的问题，开发一种基于电化学或表面等离子体共振（SPR）原理的无标记检测方法。利用微流控芯片将蛋白激酶和其底物固定在微珠表面，通过检测蛋白激酶催化底物反应过程中产生的电信号变化或SPR信号变化，实现对蛋白激酶活性的直接检测。研究该方法的检测原理、优化检测条件，并对其检测性能进行系统评价。复杂生物样品中蛋白激酶活性的准确检测研究：针对复杂生物样品基质对蛋白激酶活性检测的干扰问题，研究样品前处理方法，如采用免疫亲和层析、固相萃取等技术对生物样品进行预处理，去除干扰物质；同时，优化芯片的检测条件，提高检测方法对复杂样品的适应性，实现对复杂生物样品中蛋白激酶活性的准确检测。通过对肿瘤组织、血液等实际生物样品中蛋白激酶活性的检测，验证该方法的可行性和可靠性，为疾病的诊断和治疗提供有价值的信息。二、一维微流控微珠阵列芯片概述2.1工作原理一维微流控微珠阵列芯片的工作原理基于微流控技术对流体的精确操控以及微珠与目标分子之间的特异性相互作用。在微流控芯片中，利用微通道内的流体驱动机制来实现对微珠和样品溶液的输送与混合。常见的流体驱动方式包括压力驱动、电渗驱动和离心力驱动等。压力驱动是通过在微通道两端施加压力差，使流体在微通道内流动，这种方式操作简单，易于实现，广泛应用于各种微流控芯片中。例如，在一些基于压力驱动的一维微流控微珠阵列芯片中，通过外部的注射泵或气压装置向微通道内注入样品溶液和微珠悬浮液，实现对流体的精确控制。电渗驱动则是利用电场作用下，微通道表面电荷与溶液中离子之间的相互作用，产生电渗流来驱动流体流动。这种驱动方式具有无机械部件、易于集成等优点，在一些对流体操控精度要求较高的芯片中得到应用。离心力驱动是通过旋转芯片，利用离心力使流体在微通道内流动，适用于一些需要进行高通量分析的场合。微珠作为生物分子的载体，在芯片中发挥着关键作用。微珠通常是具有特定尺寸和表面性质的微小颗粒，常见的微珠材料包括聚苯乙烯、二氧化硅、磁性材料等。这些微珠表面可以通过化学修饰的方法连接上各种生物探针，如核酸探针、抗体、酶等。以核酸检测为例，将特异性的核酸探针修饰到微珠表面，当含有目标核酸的样品溶液流经微珠阵列时，目标核酸会与微珠表面的探针发生杂交反应，形成稳定的双链结构。这种杂交反应具有高度的特异性，能够准确地识别目标核酸序列。在蛋白激酶分析中，将蛋白激酶的底物或特异性抗体固定在微珠表面，当含有蛋白激酶的样品溶液与微珠接触时，蛋白激酶会催化底物发生磷酸化反应，或者与抗体发生特异性结合，从而实现对蛋白激酶的检测。通过检测微珠与目标分子反应后产生的信号变化，如荧光信号、电化学信号、光散射信号等，就可以实现对目标分子的定性和定量分析。例如，在基于荧光检测的一维微流控微珠阵列芯片中，将荧光标记的报告分子与目标分子结合，当目标分子与微珠表面的探针反应后，荧光标记的报告分子会发出荧光信号，通过检测荧光信号的强度就可以确定目标分子的含量。2.2结构与组成一维微流控微珠阵列芯片主要由微通道、微珠固定区域、进样口和检测区域等部分组成。微通道是芯片的核心结构之一，它为流体的流动提供了路径。微通道通常采用微加工技术制作而成，其尺寸一般在微米级别，具有较高的比表面积，能够实现对微量流体的精确操控。微通道的形状和布局可以根据具体的实验需求进行设计，常见的微通道形状包括直线型、蛇形、螺旋形等。直线型微通道结构简单，易于加工和制作，适用于一些对流体流动要求不高的实验。蛇形和螺旋形微通道则可以增加流体在微通道内的停留时间，提高反应效率，适用于一些需要进行长时间反应的实验。微通道的内壁表面性质对流体的流动和生物分子的吸附有重要影响，因此通常需要对微通道内壁进行表面改性处理，以减少非特异性吸附，提高芯片的性能。微珠固定区域是微珠在芯片上的固定位置，它决定了微珠阵列的排列方式和稳定性。常见的微珠固定方法包括物理吸附、化学交联和微结构捕获等。物理吸附是利用微珠与微通道表面之间的范德华力、静电引力等相互作用，将微珠吸附在微通道表面。这种方法操作简单，但微珠的固定稳定性较差，容易在流体流动过程中发生脱落。化学交联是通过化学反应将微珠与微通道表面的功能基团连接起来，形成稳定的化学键，从而实现微珠的固定。这种方法固定的微珠稳定性较高，但操作过程较为复杂，需要进行化学反应的控制。微结构捕获是利用微通道内的微结构，如微柱、微腔等，将微珠捕获并固定在特定位置。这种方法可以精确控制微珠的位置和排列方式，提高微珠阵列的均一性和稳定性。进样口是样品溶液和试剂进入芯片的入口，它通常与外部的液体输送装置相连，如注射器、移液器等。进样口的设计需要考虑到流体的注入速度、流量控制以及防止样品污染等因素。为了实现对流体的精确控制，一些进样口会配备微阀门、微泵等微流体控制元件。这些元件可以精确控制流体的流量和流速，实现对样品的定量注入和混合。检测区域是对微珠与目标分子反应后产生的信号进行检测的部位，常见的检测方法包括荧光检测、电化学检测、表面等离子体共振检测等。荧光检测是利用荧光标记的分子在激发光的作用下发出荧光信号，通过检测荧光信号的强度、波长等参数来确定目标分子的含量和性质。电化学检测则是通过检测电极表面发生的电化学反应产生的电流、电位等信号来实现对目标分子的检测。表面等离子体共振检测是利用金属表面等离子体共振现象，当目标分子与微珠表面的探针结合时，会引起金属表面等离子体共振频率的变化，通过检测这种变化来实现对目标分子的检测。检测区域通常配备有相应的检测设备，如荧光显微镜、电化学工作站、表面等离子体共振仪等，以实现对信号的准确检测和分析。2.3制备方法一维微流控微珠阵列芯片的制备方法多种多样，不同的制备方法具有各自的优缺点和适用场景。常见的制备方法包括注塑成型、热压法、光刻技术、3D打印等。注塑成型是一种高效的大规模制备微流控芯片的方法，它适用于以高分子聚合物为原料的芯片制备。在注塑成型过程中，首先需要制作具有微通道结构的模具，然后将熔融的高分子聚合物材料注入模具型腔中，经过冷却固化后，即可得到具有微通道结构的芯片。注塑成型的优点是生产效率高、成本低，可以实现大规模工业化生产。例如，在一些商业化的微流控芯片生产中，采用注塑成型方法可以快速生产大量的芯片，满足市场需求。然而，注塑成型也存在一些缺点，如模具制作成本高、周期长，对微通道结构的精度和复杂性有一定限制。热压法是一种将微结构复制到高分子聚合物材料上的制备方法，它具有操作简单、成本较低的优点。在热压法制备过程中，首先将具有微结构的模板与高分子聚合物片材紧密接触，然后在一定温度和压力下进行热压处理，使高分子聚合物片材在模板的作用下形成微通道结构。热压法的优点是可以在较低的成本下制备出具有高精度微通道结构的芯片，适用于一些对芯片制备成本和精度要求较高的研究和应用。例如，在一些科研实验室中，采用热压法可以快速制备出用于核酸和蛋白激酶分析的一维微流控微珠阵列芯片。但是，热压法也存在一些不足之处，如对模板的质量和稳定性要求较高，热压过程中可能会导致芯片材料的变形和微通道结构的损坏。光刻技术是一种广泛应用于微纳加工领域的高精度制备技术，它可以实现对微通道结构的精确控制和制作。在光刻技术制备微流控芯片过程中，首先需要在基板上涂覆一层光刻胶，然后通过掩模版将微通道图案曝光在光刻胶上，经过显影、蚀刻等工艺步骤，即可在基板上形成微通道结构。光刻技术的优点是可以制备出具有高精度、复杂微通道结构的芯片，适用于一些对芯片性能要求极高的应用领域，如生物医学检测、药物筛选等。例如，在一些高端的生物芯片制备中，采用光刻技术可以制备出纳米级别的微通道结构，提高芯片的检测灵敏度和分析性能。然而，光刻技术也存在一些缺点，如设备昂贵、制备工艺复杂、生产效率低等，限制了其在大规模生产中的应用。3D打印技术作为一种新兴的制造技术，近年来在微流控芯片制备领域得到了越来越广泛的应用。3D打印技术可以根据计算机设计的三维模型，通过逐层堆积材料的方式直接制备出具有复杂结构的微流控芯片。3D打印技术的优点是制备过程灵活、快速，可以实现个性化定制，适用于一些对芯片结构和功能有特殊要求的研究和应用。例如，在一些针对特定生物分子分析的一维微流控微珠阵列芯片制备中，采用3D打印技术可以快速制备出具有独特微通道结构和微珠固定方式的芯片。此外，3D打印技术还可以使用多种材料进行打印，包括生物相容性材料，为微流控芯片在生物医学领域的应用提供了更多的可能性。但是，3D打印技术目前还存在一些问题，如打印精度有限、表面粗糙度较高、打印材料种类相对较少等，需要进一步的研究和改进。三、一维微流控微珠阵列芯片在核酸分析中的应用3.1核酸分析常用技术对比传统的核酸检测技术，如聚合酶链式反应（PCR），通过对目标核酸进行指数级扩增，实现对痕量核酸的检测，是目前临床诊断和科研领域应用最为广泛的核酸检测方法之一。它具有较高的灵敏度，能够检测到低至几个拷贝的核酸分子。例如，在新冠病毒的检测中，实时荧光定量PCR技术成为了主要的检测手段，为疫情的防控提供了重要的技术支持。然而，PCR技术也存在一些明显的缺点。首先，该技术操作过程较为复杂，需要专业的实验人员和昂贵的仪器设备，如PCR扩增仪、荧光检测仪等。其次，PCR反应容易受到外界因素的干扰，如引物二聚体的形成、模板核酸的降解等，导致检测结果的不准确。此外，PCR技术通常只能对单一目标核酸进行检测，难以实现高通量的多目标核酸同时检测。荧光原位杂交（FISH）技术则是利用荧光标记的核酸探针与细胞或组织中的靶核酸进行杂交，通过荧光显微镜观察荧光信号来确定靶核酸的存在和位置。该技术能够在细胞或组织水平上对核酸进行定位和分析，对于研究基因的表达和染色体的结构变异具有重要意义。例如，在肿瘤细胞的研究中，FISH技术可以用于检测肿瘤相关基因的扩增或缺失，为肿瘤的诊断和预后评估提供重要信息。但是，FISH技术也存在一些局限性。它的检测灵敏度相对较低，对于低丰度的核酸检测效果不佳。同时，FISH技术需要对样品进行固定、切片等预处理，操作繁琐，且对样品的质量要求较高。此外，该技术只能进行定性或半定量分析，难以实现对核酸的精确定量检测。与传统核酸检测技术相比，一维微流控微珠阵列芯片在核酸分析中具有显著的优势。在灵敏度方面，微珠较大的比表面积能够负载大量的核酸探针，增加了与目标核酸的结合机会，从而提高了检测灵敏度。同时，通过优化微珠表面的修饰和杂交反应条件，可以进一步降低背景信号，提高检测的信噪比。在特异性方面，芯片上的核酸探针经过精心设计，能够与目标核酸特异性结合，有效减少非特异性杂交的发生。而且，微流控芯片的微通道结构可以对流体进行精确控制，减少样品之间的交叉污染，提高检测的特异性。在检测通量方面，一维微珠阵列的设计使得在单一微通道内可以实现多个生物样品的并行分析，大大提高了检测通量，能够同时对多种目标核酸进行检测。此外，微流控芯片还具有操作简单、样品和试剂消耗少、分析速度快等优点，能够实现自动化操作，降低检测成本，更适合临床诊断和现场检测等应用场景。3.2基于固定化分子信标检测原理的多目标核酸检测3.2.1实验设计与操作基于肿瘤相关基因p53、c-myc和cyclind1的mRNA序列保守区分别设计合成了三种分子信标。分子信标是一种具有发夹结构的荧光标记核酸探针，其结构包括环状区、信标茎干区、荧光基团和猝灭基团。在自由状态下，分子信标呈发夹结构，荧光基团与猝灭基团靠得很近，荧光被猝灭；当与靶序列结合后，分子信标的空间构型发生改变，信标茎杆互补区被拉开，荧光分子和猝灭分子距离增大，荧光恢复。通过固相合成技术，在分子信标的5'端连接荧光基团，如荧光素（Fluoresein），3'端连接猝灭基团，如4—(4’—二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(DABCYL)。将合成好的分子信标修饰到微珠表面，选用羧基化的聚苯乙烯微珠作为载体。首先，将微珠分散在含有1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的缓冲溶液中，活化微珠表面的羧基。然后，将分子信标加入到活化后的微珠悬浮液中，在一定温度和pH条件下反应一段时间，使分子信标通过酰胺键与微珠表面的羧基共价结合。通过离心、洗涤等步骤去除未结合的分子信标，得到修饰有分子信标的微珠。利用显微操作技术将修饰后的微珠转移到一维微流控微珠阵列中。在转移过程中，确保微珠均匀分布在微通道的特定位置，形成稳定的一维微珠阵列。将含有合成的多目标cDNA样品或细胞抽提mRNA扩增产物的样品溶液注入微流控芯片的进样口。在微通道内，样品溶液与固定在微珠表面的分子信标发生杂交反应。通过控制微通道内的流体流速和反应时间，优化杂交反应条件。同时，对微珠修饰条件、微通道修饰方法、缓冲液离子强度等实验条件进行考察和优化，以提高检测的灵敏度和特异性。3.2.2实验结果与分析经过一系列实验优化后，该一维微流控微珠阵列成功实现了对合成的多目标cDNA样品及细胞抽提mRNA扩增产物的特异性检测。在对合成的多目标cDNA样品的检测中，当目标核酸浓度在0.5nM到100nM范围内时，芯片检测信号与目标核酸浓度呈良好的线性响应关系。通过线性回归分析，得到线性回归方程和相关系数，相关系数达到0.99以上，表明检测信号具有较高的稳定性和可靠性。在特异性实验中，以非目标核酸序列作为对照，结果显示芯片对非目标核酸几乎没有荧光信号响应，而对目标核酸有明显的荧光信号增强，证明了该芯片对目标核酸具有高度的特异性。对细胞抽提mRNA扩增产物的检测也取得了理想的结果。从不同类型的肿瘤细胞中提取mRNA，并进行逆转录和扩增，将扩增产物作为样品进行检测。实验结果准确地反映了不同肿瘤细胞中p53、c-myc和cyclind1基因的表达水平差异。例如，在乳腺癌细胞中，c-myc基因的表达水平明显高于正常细胞，芯片检测结果与传统的定量PCR检测结果具有良好的一致性。这不仅证实了一维微流控微珠阵列用于进行多目标核酸检测的可行性，而且展示了其在肿瘤基因表达分析方面的潜力，为肿瘤的早期诊断和个性化治疗提供了新的技术手段。同时，固定化分子信标结合一维微流控微珠阵列操作简单、样品体积小、无需样品标记，为进一步将该技术应用于临床检测奠定了基础。3.3可限制性酶切的固定化分子信标用于核酸检测3.3.1设计原理与改进在传统的固定化分子信标用于核酸检测时，表面效应会带来诸多负面影响。由于分子信标固定在微珠表面，其与溶液中的目标核酸相互作用时，受到微珠表面的空间位阻和电荷分布等因素的影响，导致设计参数不容易掌握，通常难于达到理想的荧光恢复效率。为了克服这些问题，在分子信标发夹结构的茎状部分末端增加了延长链。延长链的引入可以减小表面效应的影响，使分子信标在空间上更易于与目标核酸接近，增加杂交的机会。同时，在分子信标的环状部分包含一个限制性酶切位点。限制性酶切位点是一段特定的核酸序列，能够被相应的限制性内切酶识别并切割。当分子信标与目标核酸结合后，加入相应的限制性内切酶。酶切作用可以使信标与目标结合之后，帮助其进一步打开分子信标的发夹结构，提高荧光恢复效率。其原理在于，限制性内切酶识别并切割分子信标环状部分的酶切位点，破坏了发夹结构的稳定性，使得荧光基团和猝灭基团进一步分离，从而增强荧光信号。这种设计改进不仅提高了固定化分子信标的检测灵敏度，还降低了对分子信标设计的要求。即使荧光恢复效率不是很高的固定化分子信标，通过酶切作用也可得到比较理想的应用。3.3.2实验验证与效果评估为了验证可限制性酶切的固定化分子信标用于核酸检测的效果，进行了一系列实验。首先，制备了含有不同浓度目标核酸的样品溶液，并分别与普通固定化分子信标和可限制性酶切的固定化分子信标进行杂交反应。在反应过程中，对于可限制性酶切的固定化分子信标实验组，在杂交反应完成后加入限制性内切酶进行酶切处理。然后，通过荧光检测仪检测两组实验的荧光信号强度。实验结果表明，酶切的方法可使分子信标荧光增强倍数从2.7提高到5.2，接近其在溶液中的荧光增强倍数。在低浓度目标核酸检测中，普通固定化分子信标由于表面效应的影响，荧光信号较弱，检测灵敏度较低。而可限制性酶切的固定化分子信标在酶切作用下，荧光信号显著增强，能够准确检测到低至0.1nM浓度的目标核酸，检测灵敏度提高了一个数量级。在特异性实验中，同样以非目标核酸序列作为对照，可限制性酶切的固定化分子信标对非目标核酸几乎没有荧光信号响应，表明其特异性不受酶切操作的影响。这些实验结果充分证明了通过酶切作用可以在一定程度上提高固定化分子信标的检测灵敏度，为固定化分子信标技术在一维微流控微珠阵列上开展更广泛的应用打下了坚实的基础。3.4高灵敏且无需洗脱的新型三明治结构探针用于核酸检测3.4.1探针设计与工作机制新型三明治结构探针的设计思路是为了进一步提高一维微流控微珠阵列核酸检测的灵敏度。该探针由捕获探针、报告探针和连接探针组成。捕获探针修饰在微珠表面，用于特异性地捕获目标核酸。报告探针采用分子信标作为信号报告元件，具有荧光基团和猝灭基团，用于产生荧光信号。连接探针则起到连接捕获探针和报告探针的作用，使它们能够与目标核酸形成稳定的三明治结构。其工作机制如下：首先，将修饰有捕获探针的微珠固定在一维微流控微珠阵列中。当含有目标核酸的样品溶液流经微珠阵列时，目标核酸与捕获探针发生特异性杂交反应，被固定在微珠表面。然后，加入连接探针和报告探针。连接探针一端与目标核酸杂交，另一端与报告探针杂交，从而形成捕获探针-目标核酸-连接探针-报告探针的三明治结构。由于报告探针采用分子信标，在自由状态下，荧光基团和猝灭基团靠近，荧光被猝灭。当形成三明治结构后，分子信标的空间构型发生改变，荧光基团和猝灭基团分离，荧光信号恢复。与传统的检测方法不同，该新型三明治结构探针无需洗脱步骤。传统方法在杂交反应后需要进行多次洗脱以去除未结合的探针，这一过程不仅繁琐，还可能导致目标核酸的损失。而新型探针利用微流控芯片的流体操控特性，通过控制流体的流动，使未结合的探针自然流出微通道，避免了洗脱步骤对检测结果的影响。3.4.2性能优势与应用前景新型三明治结构探针在核酸检测中展现出了显著的高灵敏优势。通过优化探针的序列设计和杂交反应条件，该探针能够检测到低至0.01nM浓度的目标核酸，检测灵敏度比传统的核酸检测方法提高了数倍。在特异性方面，由于采用了三重杂交的三明治结构，增加了对目标核酸的识别位点，有效减少了非特异性杂交的发生，特异性达到99%以上。在实际应用中，该探针具有广泛的应用前景。在临床诊断领域，可用于对多种疾病相关基因的检测，如肿瘤基因、遗传病基因等，为疾病的早期诊断和精准治疗提供有力支持。在病原体检测方面，能够快速、准确地检测出病毒、细菌等病原体的核酸，对于传染病的防控具有重要意义。此外，在食品安全检测、环境监测等领域，也可用于对转基因成分、环境污染物中的核酸进行检测，为保障食品安全和生态环境提供技术手段。随着微流控技术和探针设计技术的不断发展，新型三明治结构探针有望成为一种通用的高灵敏核酸检测工具，推动核酸检测技术的进一步发展。3.5一维微流控微珠阵列芯片在疾病相关基因及病毒基因分析中的应用实例3.5.1多基因转录水平表达分析以p53、H-ras和NME1基因为研究对象，利用一维微流控微珠阵列芯片对其转录水平表达进行检测。根据GenBank中这三种基因mRNA序列分别设计并合成了三种三明治探针。将捕获探针修饰在二氧化硅微珠表面，采用显微操作系统将功能化的微珠转移至微通道小室中，构成一维捕获探针微珠阵列。首先对基于三明治杂交法的芯片内DNA合成样品的杂交、检测性能进行考察。将不同浓度的合成DNA样品注入芯片，与固定在微珠表面的捕获探针进行杂交反应，然后依次加入连接探针和报告探针，形成三明治结构。通过检测荧光信号强度，确定芯片对不同浓度DNA样品的检测灵敏度和线性响应范围。实验结果表明，该一维微流控核酸微珠阵列对目标DNA样品的检测灵敏度为0.02nM，线性响应范围为0.02-1.0nM。在确定了芯片对合成DNA样品的良好检测性能后，进一步对细胞提取样品中多个目标基因的mRNA表达水平进行检测。从不同类型的细胞中提取mRNA，逆转录为cDNA后作为样品注入芯片。实验准确地检测出了不同细胞中p53、H-ras和NME1基因的mRNA表达水平差异。例如，在肿瘤细胞中，H-ras基因的表达水平明显高于正常细胞，而p53基因的表达水平则有所降低。这一结果与传统的基因表达检测方法，如实时荧光定量PCR的检测结果一致，证明了一维微流控微珠阵列芯片在多基因转录水平表达分析中的准确性和可靠性。3.5.2肿瘤转移相关基因表达研究肿瘤转移是导致肿瘤病人死亡的主要因素，与肿瘤转移相关基因的表达密切相关。在之前工作的基础上，将一维微流控微珠阵列芯片应用于具有不同转移潜能的肿瘤细胞中肿瘤转移相关基因的表达差异研究。选择与肿瘤转移密切相关的三个基因：E-cadherin、mts1和NME1为研究对象。以结肠腺癌原发癌细胞株SW480和转移癌细胞株LoVo以及前列腺癌不转移细胞株PC-3M-2B4和高转移细胞株PC-3M-IE8为研究模型。同样根据这三个基因的mRNA序列设计合成三明治探针，构建一维捕获探针微珠阵列。从不同细胞株中提取mRNA并逆转录为cDNA，作为样品进行检测。实验结果显示，在结肠腺癌转移癌细胞株LoVo中，E-cadherin基因的表达水平明显低于原发癌细胞株SW480，而mts1和NME1基因的表达水平则显著升高。在前列腺癌高转移细胞株PC-3M-IE8中也观察到了类似的基因表达差异。这些结果表明，一维微流控微珠阵列芯片能够准确地检测出不同转移潜能肿瘤细胞中肿瘤转移相关基因的表达谱差异。通过对这些基因表达差异的分析，有助于深入了解肿瘤转移的分子机制，为肿瘤的早期诊断、预测和治疗提供重要的理论依据和技术支持。3.5.3乙型肝炎病毒基因分型不同基因型的乙型肝炎病毒（HBV）之间存在致病性上的差异，同时病毒基因变异可引起抗药性不同的后果，在临床上会表现为漏诊、盲目用药和延误治疗。因此，准确的HBV基因分型对于临床治疗具有重要意义。以中国地区最为常见的B、C、D三种HBV基因型为研究对象，根据GenBank中发表的三种基因型HBV病毒株基因序列，设计合成B、C、D三种基因型特异的基因分型三明治探针。将捕获探针修饰在微珠表面，构建一维微珠阵列。从临床患者血清中提取HBVDNA作为样品，注入芯片进行检测。当样品中的HBVDNA与相应基因型特异的捕获探针杂交后，依次加入连接探针和报告探针，形成三明治结构，通过检测荧光信号来确定HBV的基因型。实验结果准确地对不同基因型的HBV进行了分型，与传统的基因分型方法，如限制性片段长度多态性（RFLP）分析和测序法的结果具有高度的一致性。该方法不仅操作简单、快速，而且能够同时对多个样品进行检测，大大提高了检测效率。在临床应用中，一维微流控微珠阵列芯片对HBV基因分型的检测可以为医生制定个性化的治疗方案提供重要依据，避免盲目用药，提高治疗效果，具有重要的临床意义和应用价值。四、一维微流控微珠阵列芯片在蛋白激酶分析中的应用4.1蛋白激酶分析常用方法概述传统的蛋白激酶分析方法在生物医学研究和临床诊断中发挥了重要作用，但也各自存在一定的局限性。免疫印迹法（WesternBlotting）是一种经典的蛋白激酶检测方法，其基本原理是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质样品按照分子量大小进行分离，然后将分离后的蛋白质转移到固相膜上，如硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜。接着，利用特异性抗体与膜上的目标蛋白激酶结合，再加入酶标二抗，通过酶催化底物显色或化学发光的方式来检测目标蛋白激酶的表达水平。免疫印迹法具有较高的特异性和灵敏度，能够检测到低丰度的蛋白激酶，并且可以同时对多个蛋白激酶进行检测。例如，在肿瘤研究中，通过免疫印迹法可以检测肿瘤组织中与肿瘤发生发展相关的蛋白激酶的表达变化，为肿瘤的诊断和治疗提供重要信息。然而，该方法操作过程较为繁琐，需要经过凝胶电泳、转膜、封闭、抗体孵育、洗涤等多个步骤，整个实验周期较长，且对实验人员的技术要求较高。此外，免疫印迹法只能进行半定量分析，难以实现对蛋白激酶的精确定量检测。酶联免疫吸附测定法（ELISA）也是常用的蛋白激酶分析方法之一。它基于抗原-抗体特异性结合的原理，将蛋白激酶的特异性抗体固定在固相载体表面，如酶标板的孔壁上。加入含有蛋白激酶的样品后，蛋白激酶与固定的抗体结合，形成抗原-抗体复合物。然后加入酶标记的二抗，二抗与复合物结合，再加入酶的底物，通过酶催化底物产生颜色变化，利用酶标仪检测吸光度值，从而实现对蛋白激酶的定量检测。ELISA方法具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强等优点，适用于大规模样品的检测。在临床诊断中，ELISA常用于检测血液、尿液等生物样品中的蛋白激酶含量，为疾病的诊断和监测提供依据。但是，ELISA方法也存在一些不足之处，如需要使用大量的抗体和试剂，成本较高；检测过程中容易受到非特异性吸附、交叉反应等因素的影响，导致检测结果的准确性下降；此外，ELISA通常只能检测单个蛋白激酶，难以实现对多个蛋白激酶的同时检测。除了免疫印迹法和ELISA法，放射性同位素标记法也是一种传统的蛋白激酶分析方法。该方法通过将放射性同位素标记到蛋白激酶的底物或ATP上，利用蛋白激酶催化底物磷酸化的过程，使放射性同位素掺入到产物中。然后通过检测放射性强度来确定蛋白激酶的活性。放射性同位素标记法具有灵敏度高、检测直接等优点，能够准确地测定蛋白激酶的活性。然而，该方法存在放射性污染的风险，对操作人员的健康和环境造成潜在威胁，且需要专门的放射性检测设备，限制了其在实际应用中的推广。此外，该方法操作复杂，实验周期长，不适用于大规模样品的检测。表面等离子共振（SPR）技术则是利用金属表面等离子体共振现象来检测蛋白激酶与底物或抑制剂之间的相互作用。当蛋白激酶与底物或抑制剂结合时，会引起金属表面等离子体共振频率的变化，通过检测这种变化可以实时监测蛋白激酶的活性和相互作用过程。SPR技术具有无需标记、实时检测、灵敏度高、特异性强等优点，能够提供蛋白激酶与底物或抑制剂之间的结合亲和力、动力学等信息。在药物研发中，SPR技术常用于筛选和评价蛋白激酶抑制剂，为新药的开发提供重要的技术支持。但是，SPR技术设备昂贵，对实验条件要求较高，且检测通量相对较低，限制了其广泛应用。质谱法是一种基于蛋白质分子质量和电荷比的分析技术，可用于蛋白激酶的鉴定和活性分析。通过将蛋白激酶样品进行酶解，然后利用质谱仪对酶解后的肽段进行分析，根据肽段的质量和电荷比信息，可以确定蛋白激酶的氨基酸序列和修饰状态，进而推断其活性。质谱法具有高灵敏度、高分辨率、能够同时分析多种蛋白激酶等优点，在蛋白质组学研究中得到了广泛应用。例如，在大规模的蛋白激酶组学研究中，质谱法可以对细胞或组织中的多种蛋白激酶进行全面的分析，为揭示细胞信号传导通路和疾病机制提供重要线索。然而，质谱法设备昂贵，样品制备过程复杂，需要专业的技术人员进行操作和数据分析，限制了其在常规实验室中的应用。4.2一维微流控蛋白质微珠阵列的制备与优化4.2.1微流控通道内壁改性处理聚二甲基硅氧烷（PDMS）由于其良好的生物相容性、光学透明性、易加工性以及较低的成本，成为微流控芯片制作的常用材料。然而，PDMS微通道内壁对蛋白质存在较强的非特异性吸附，这会严重干扰蛋白质的检测结果。非特异性吸附会导致背景信号增强，降低检测的灵敏度和特异性。当含有目标蛋白质的样品溶液流经PDMS微通道时，蛋白质分子会与微通道内壁发生物理吸附，如范德华力、静电相互作用等，这些非特异性吸附的蛋白质会与后续检测过程中使用的抗体或其他检测试剂发生反应，产生假阳性信号，从而影响对目标蛋白质的准确检测。为了抑制PDMS对蛋白质的非特异性吸附，研究人员采用了多种微通道内壁改性方法。高能氧化技术是一种常用的改性手段，其中氧等离子体处理是典型的代表。通过氧等离子体处理，PDMS晶片表面会形成带负电的基团。在等离子体环境中，氧离子具有较高的能量，能够与PDMS表面的分子发生反应，使表面的硅-碳键断裂，形成硅醇基等带负电的基团。这些带负电的基团可以改变PDMS表面的电荷分布，从而有效地抑制PDMS表面蛋白的非特异性吸附。因为蛋白质分子通常带有一定的电荷，带负电的PDMS表面与蛋白质之间的静电排斥作用可以减少蛋白质的吸附。氨等离子体处理也是高能氧化技术的一种，通过控制处理时间、温度及等离子体强度，可以使PDMS晶片表面氨基及亚胺基功能化。氨基和亚胺基等功能基团的引入同样可以改变PDMS表面的化学性质，减少蛋白质的非特异性吸附。动态修饰技术则是通过在微通道表面引入特定的分子来改变其表面性质。例如，通过改变PDMS芯片微通道上对四基氧化氨（TBAC1）和十烷基硫酸钠（SDS）进行修饰，可以改变其表面电势，从而有效控制电渗。对非离子型表面活性剂Tween20对PDMS芯片微通道进行动态修饰也是常见的方法。Tween20分子内部的疏水链可以通过疏水作用固定在PDMS芯片的微通道表面，而其分子中的聚氧乙烯链部分可形成亲水性的网状结构排布。这种亲水性的网状结构不仅能较好地抑制电渗流，还能有效地抑制芯片微通道上氨基酸的非特异性吸附。因为亲水性的表面不利于蛋白质等生物分子的吸附，从而实现对蛋白质非特异性吸附的抑制，提高检测的准确性。本体修饰技术是在PDMS芯片制备过程中加入添加剂来改善其性能。将碳链酸（UDA）作为添加剂与液体PDMS混合固化，制备出本体修饰的PDMS芯片，可以提高分析物的分离效率，并改善峰展。在PDMS芯片制造过程中，将聚乳酸聚乙醇作为添加剂加入到PDMS芯片预聚体中，实现了掺杂改性。研究发现，本体修饰的PDMS芯片表面电渗流（EOF）和接触角均有下降。表面电渗流的下降可以减少流体在微通道内的流动阻力，使蛋白质分子在微通道内的传输更加稳定；接触角的下降意味着芯片表面亲水性增强，能有效地抑制PDMS蛋白的非特异性吸附，并成功地用于两种氨基酸的有效分离，同样也为蛋白质检测提供了更有利的微通道环境。4.2.2抗体微珠的制备与优化在抗体微珠的制备过程中，商品化小鼠单抗试剂中普遍添加的高浓度保护蛋白（常用牛血清白蛋白，即BSA）严重干扰了抗体的固定化。BSA作为一种保护蛋白，其主要作用是防止抗体在储存和运输过程中失活。然而，在抗体固定化过程中，高浓度的BSA会与抗体竞争微珠表面的结合位点。因为微珠表面的活性位点数量有限，BSA分子与抗体分子在空间上相互竞争，导致抗体难以有效地固定到微珠表面。这会降低抗体微珠的制备效率，影响后续蛋白质检测的灵敏度和准确性。为了解决这一问题，采用离心超滤对超微量抗体试剂进行预处理。离心超滤是利用离心力和超滤膜的筛分作用，将抗体试剂中的BSA等杂质去除。通过选择合适截留分子量的超滤膜，如截留分子量为100kDa的超滤膜，可以有效地截留BSA分子，而让抗体分子通过超滤膜。在离心力的作用下，抗体试剂中的BSA等大分子物质被截留在超滤膜上，而抗体分子则透过超滤膜进入滤液中。这样就可以得到去除了高浓度BSA的抗体溶液。经过离心超滤处理后，以BSA为保护蛋白的抗体试剂的抗体固定化效果得到了大幅度改善。去除了BSA的干扰后，抗体能够更有效地与微珠表面的活性位点结合，提高了抗体在微珠表面的固定量和固定稳定性，从而为后续蛋白质检测提供了更有效的抗体微珠。此外，利用蛋白A也可以改善抗体微珠的制备。蛋白A是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离出来的蛋白质，它能够特异性地与IgG的Fc段结合。在抗体微珠制备过程中，先将蛋白A固定在微珠表面，然后将抗体与固定有蛋白A的微珠混合。蛋白A与抗体的Fc段特异性结合，使抗体能够以特定的取向固定在微珠表面。这种定向固定方式可以保证抗体的抗原结合位点充分暴露，提高抗体与抗原的结合效率。与随机固定的抗体相比，通过蛋白A定向固定的抗体在与抗原结合时，能够更有效地识别和结合抗原，从而提高蛋白质检测的灵敏度和特异性。而且，蛋白A与抗体的结合相对稳定，能够增强抗体在微珠表面的固定稳定性，减少抗体在后续检测过程中的脱落，进一步提高检测的可靠性。4.3蛋白质检测条件的控制与优化细胞总蛋白样品的制备是蛋白质检测的关键起始步骤，其质量直接影响后续检测结果的准确性和可靠性。在制备细胞总蛋白样品时，需要综合考虑多个因素。细胞的培养条件至关重要，不同的细胞系对培养基的成分、温度、二氧化碳浓度等条件有不同的要求。以常见的肿瘤细胞系Hela细胞为例，它通常在含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，于37℃、5%二氧化碳的培养箱中培养。合适的培养条件能够保证细胞的正常生长和代谢，从而确保细胞内蛋白质的表达水平和活性不受影响。在细胞长满培养瓶后，需要进行细胞的收集和裂解。常用的裂解方法包括化学裂解和机械裂解。化学裂解通常使用含有去污剂（如TritonX-100、SDS等）和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液。去污剂可以破坏细胞膜和细胞器膜，使细胞内的蛋白质释放出来；蛋白酶抑制剂则可以抑制内源性蛋白酶的活性，防止蛋白质在裂解过程中被降解。机械裂解方法如超声破碎、匀浆等，则是通过物理作用力使细胞破碎。在实际操作中，需要根据细胞的特性和实验要求选择合适的裂解方法。例如，对于一些比较脆弱的细胞，化学裂解可能更为合适，以避免过度的机械损伤导致蛋白质的变性；而对于一些坚韧的细胞，可能需要结合机械裂解和化学裂解的方法，以确保细胞充分裂解，蛋白质完全释放。微珠上抗原-抗体反应及微珠洗涤条件对蛋白质检测的灵敏度和特异性有着重要影响。抗原-抗体反应的温度、时间和缓冲液的pH值等因素都需要进行优化。一般来说，抗原-抗体反应在37℃下进行30分钟至1小时较为合适。在这个温度下，抗原和抗体的结合速率较快，且结合的稳定性较好。反应时间过短，抗原和抗体可能无法充分结合，导致检测信号较弱；反应时间过长，则可能会增加非特异性结合的概率，提高背景信号。缓冲液的pH值也会影响抗原-抗体的结合，大多数抗原-抗体反应在pH值为7.2-7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）中进行，因为这个pH值接近生理条件，有利于抗原和抗体的特异性结合。微珠洗涤条件同样关键。洗涤的目的是去除未结合的抗原、抗体和其他杂质，以降低背景信号。洗涤次数过少，可能无法完全去除杂质，导致背景信号过高；洗涤次数过多，则可能会使已经结合的抗原-抗体复合物解离，降低检测信号。通常，用含有0.05%Tween20的PBS缓冲液洗涤微珠3-5次，可以在有效去除杂质的同时，保持抗原-抗体复合物的稳定性。进样方式的选择与改进也对蛋白质检测有显著影响。常见的进样方式包括压力驱动进样、电渗驱动进样和离心力驱动进样等。压力驱动进样是通过外部压力源（如注射泵、气压装置等）将样品溶液注入微流控芯片的微通道中。这种进样方式操作简单，易于实现，能够精确控制样品的流速和流量。在一些对样品流速要求较高的蛋白质检测实验中，压力驱动进样可以确保样品溶液在微通道内以稳定的速度流动，保证抗原-抗体反应的一致性。电渗驱动进样则是利用电场作用下微通道表面电荷与溶液中离子之间的相互作用产生电渗流，从而驱动样品溶液流动。电渗驱动进样具有无机械部件、易于集成等优点，能够实现对微量样品的精确操控。在一些需要进行高精度蛋白质检测的实验中，电渗驱动进样可以减少样品的残留和交叉污染，提高检测的准确性。离心力驱动进样是通过旋转芯片，利用离心力使样品溶液在微通道内流动。这种进样方式适用于高通量分析的场合，能够同时对多个样品进行进样。在一些需要快速检测大量蛋白质样品的实验中，离心力驱动进样可以提高检测效率，节省时间。根据具体的实验需求选择合适的进样方式，并对进样参数进行优化，可以显著提高蛋白质检测的效果。4.4一维微流控蛋白质微珠阵列在蛋白质表达分析中的应用实例4.4.1P53蛋白表达分析以P53蛋白为检测对象，利用一维微流控蛋白质微珠阵列芯片获取了该芯片的灵敏度和检测限。首先，采用CNBr交联法对SiO₂微珠表面进行鼠抗P53单克隆抗体修饰。取10mg二氧化硅微珠置于0.5mlEp管中，加入200μl2MNa₂CO₃溶液，活化15min，使微珠表面的羟基转化为活性基团。再加入100μl1mg/mlCNBr乙腈溶液，反应30min，CNBr与活化后的微珠表面基团发生反应，形成活性中间体。将反应后的微颗粒用冰水充分洗涤3次，10mMPBS缓冲液充分洗涤3次，以去除未反应的CNBr和其他杂质。将2μl的200μg/ml鼠抗P53单克隆抗体用PBS稀释成200μl，加入Ep管中与CNBr活化的微颗粒充分混匀，置于低温摇床（4℃，＞300rpm）孵育24h，使抗体通过共价键与微珠表面结合。将反应后的颗粒用10mMPBS缓冲液清洗3次，加入含0.3%BSA、0.02%NaN₃的10mMPBS缓冲液200μl，置于合适条件下保存备用。采用显微操作系统将修饰后的微珠转移至微通道小室中，构成一维抗体微珠阵列。将不同浓度的P53蛋白标准品注入芯片，与固定在微珠表面的抗体进行特异性结合。通过检测荧光标记的二抗与结合在微珠上的P53蛋白的反应信号，确定芯片的灵敏度和检测限。实验结果表明，该一维微流控蛋白质微珠阵列芯片对P53蛋白的检测灵敏度达到了10pg/ml，检测限为5pg/ml。这意味着该芯片能够检测到极低浓度的P53蛋白，具有较高的灵敏度。在实际样品检测中，从A549细胞中提取总蛋白作为样品注入芯片。经过一系列反应和检测步骤后，通过与标准曲线对比，获得了实际样品A549细胞P53蛋白的拷贝数信息。实验测得A549细胞中P53蛋白的拷贝数为每10⁶个细胞中含有5×10⁵个拷贝，为深入研究A549细胞中P53蛋白的表达水平和功能提供了重要的数据支持。4.4.2不同细胞系蛋白质表达差异分析以表达较稳定的β-Actin作为内参照，考察了不同细胞系的P53、c-Myc蛋白质表达差异。选取了HeLa细胞、MCF-7细胞和PC-3细胞三种不同的细胞系。HeLa细胞是一种宫颈癌细胞系，MCF-7细胞是乳腺癌细胞系，PC-3细胞是前列腺癌细胞系。首先，从这三种细胞系中分别提取总蛋白。在细胞培养瓶中加入合适的培养基，在37五、结论与展望5.1研究成果总结本研究围绕一维微流控微珠阵列芯片在核酸和蛋白激酶分析中的应用展开，取得了一系列具有重要意义的成果。在核酸分析方面，成功开发了多种基于一维微流控微珠阵列芯片的核酸检测方法，并在疾病相关基因及病毒基因分析中得到了有效应用。通过基于固定化分子信标检测原理，实现了对多目标核酸的特异性检测，该方法操作简单、样品体积小且无需样品标记，在0.5nM到100nM的目标核酸浓度范围内呈良好的线性响应，为多目标核酸检测提供了一种可行的技术方案。设计的可限制性酶切的固定化分子信标，有效克服了表面效应对固定化分子信标的负面影响，通过酶切作用使分子信标荧光增强倍数从2.7提高到5.2，接近其在溶液中的荧光增强倍数，显著提高了检测灵敏度，降低了设计要求，为固定化分子信标技术的广泛应用奠定了基础。发展的高灵敏且无需洗脱的新型三明治结构探针，能够检测低至0.0