CN118530865B 一种异戊烯醇利用途径依赖的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用 （华南理工大学）

isopentenolutilization.一种异戊烯醇利用途径依赖的酿酒酵母工种异戊烯醇利用途径依赖的酿酒酵母工程菌及特点：天然甲羟戊酸途径失活，PRM10基因中第156位氨基酸由亮氨酸突变为谷氨酰胺，且含有磷酸激酶SmDAGK或其突变体，以及磷酸激酶AtIPK或其突变体。该酿酒酵母工程菌能高效表2所述的甲羟戊酸途径失活是通过基因编辑技术使甲羟戊酸途径中的ERG13基因缺失或所述的SmDAGK的突变体为SmDAGKS47A,L124A；所述的AtIPK的突变体为AtIPKS270P,A272R；所述的酒酵母工程菌的出发菌株为CEN.PK系列的酿2.权利要求1所述的异戊烯醇利用途径依赖的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在（1）将酿酒酵母出发菌株基因组中PRM10基因第156位氨基酸由亮氨酸突变为谷氨酰3.根据权利要求2所述的异戊烯醇利用途径依赖的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特4.根据权利要求3所述的异戊烯醇利用途径依赖的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特所述的突变中使用的sgRNA的特异性20nt的序列为TCATTGGCATTAATCC所述的整合中的供体片段具有如下结构A_B；其中，A是将磷酸激酶S5.根据权利要求4所述的异戊烯醇利用途径依赖的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特6.根据权利要求5所述的异戊烯醇利用途径依赖的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特7.权利要求1所述的异戊烯醇利用途径依赖的酿酒酵母工程菌在合成萜类前体物质或34萜类化合物的生产提供了可持续和可扩展的解[0003]甲羟戊酸途径和甲基赤藓糖醇4一磷酸途径是萜类化合物的两种经典的天然生物潜力的替代途径。IUP的特点是由廉价的大宗化学品异戊烯醇经两步磷酸化转化为萜类化cerevisiae)作为一种被广泛应用的真核模式生物，由于其明确的遗传背景和成熟的遗传[0006]本发明的另一目的在于提供上述异戊烯醇利用途径依赖的酿酒酵母工程菌的构[0007]本发明的再一目的在于提供上述异戊烯醇利用途径依赖的酿酒酵母工程菌的应5[0012]所述的SmDAGK的氨基酸序列如Genbank登录号为AAA26867.1所示，为137个氨基[0014]所述的AtIPKS270P,A272R指的是AtIPK第270位氨基酸由丝氨酸突变为[0016]所述的异戊烯醇利用途径依赖的酿酒酵母工程菌的出发菌株优选为CEN.PK系列[0018](1)将酿酒酵母出发菌株基因组中PRM10基因第156位氨基酸由亮氨酸突变为谷氨[0020]步骤(1)中所述的出发菌株优选为CEN.PK系列的酿酒酵母；更优选为酿酒酵母[0025]步骤(2)中所述的整合中的供体片段具有如下结构A_B；其中，A是将磷酸激酶SmDAGK或其突变体的编码基因的上下游构建入启动子和终止子得到的片段；B是将磷酸激酶AtIPK或其突变体的编码基因的上下游构建入启动子和终止子得到[0031]步骤(2)中所述的使得甲羟戊酸途径失活是在整合时使得甲羟戊酸途径中的关键6合在合成萜类前体物质或者萜类化合物中进行[0037](1)本发明提供的工程菌具有更适途径的表达，异戊烯醇利用途径依赖的菌株拥[0038](2)本发明提供的工程菌具有能高效利用底物，异戊烯醇利用途径依赖的菌株的[0039](3)本发明提供的工程菌的萜类化合物产率更高，与非异戊烯醇利用途径依赖的[0043]图4是野生型SmDAGK和AtIPK与突变体SmDAGKS47A,L124A和S270P,A272R的效率比较结果[0045]图6是异戊烯醇利用途径依赖的菌株与非异戊烯醇利用途径依赖的菌株的角鲨烯7[0056]使用引物PRM10sg_F和PRM10sg_R扩增pYZ463(从addgenePlasmid#187971，TEF1p_Cas9_CYC1tandSNR52p_Not1_SUP4t)，然后经大肠杆菌DH5α转[0057]TGCAGTTACACAAGGCTCATTGGCATTAATCCAACCAGGTTATATTATTCTGTGTGGTGCACTAGAAC[0058]使用Frozen_EZ酵母转化试剂盒，将1μgpYZ463_PRM10质粒和100ngPRM10位点[0060]通过公司合成核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的SmDAGKS47A,L124A基因和核苷酸序R引物将两个基因扩增出来，得到SmDAGKS47A,L124A基因片段和AtIPKS270P,A272R基因片段。以pY26_GPD_TEF(名称亦为pY26TEF_GPD)质粒(BioVectorNTCC质粒载体菌种细胞基因保藏8[0062]通过公司合成核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的野生型Sm取和测序验证，最终可以得到以GATTGGTTGACACATTGAGT为sgRNADNA的Crispr_Cas9质粒，,L124A_PGPD_PTEF1_AtIPKS270P,A272R_TADH1质粒作为模板进行PCR扩增，纯化得到的DNA为TCYC1_[0066]使用Frozen_EZ酵母转化试剂盒，将1μgpYZ463_ERG13质粒和1μgERG13位点的(isoprenol)的尿嘧啶缺陷培养基琼脂板上以及添加了5mM甲羟戊酸的尿嘧啶(Uracil)缺替换了甲羟戊酸途径(如图5所示)，得到的TADH1R引物对进行PCR验证，得到的菌株属于非异戊烯醇利用途径依赖菌株，命名为MVA_IUP1。[0069]分别将非异戊烯醇利用途径依赖菌株MVA_IUP1和异戊烯醇利用途径依赖菌IUP2累量，发现异戊烯醇利用途径依赖菌株