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DB34DB34/T3307—2018Protocolformolecularmarkerassisted-selectionofriceblastresistancegenePi1andPi2PCRmethod2018-12-29发布2019-01-29实施安徽省市场监督管理局发布I1GB/T6682分析实验室用水规CTAB：cetyltrimethylammoniumbromide，DNA：deoxyribonucleicaciddNTPs：deoxyribonucleosidetriphoPAGE：polyacrylamidegelelectrophoresis，聚PCR：polymerasechainreaction，聚合SSR：simplesequencere的DNA，利用筛选的特异性检测引物对样品DNA进行PCR扩增，依据是否扩增获得预期大小的DNA2高压灭菌锅、超纯水仪、高速离心机、恒温水浴锅（30℃~100℃)、核酸蛋白测定仪、组织研磨去离子甲酰胺、溴酚蓝、二甲苯青FF、丙烯酰胺、取待检样品的去壳种子、幼苗或叶片约200～300mg置于2.0mL离心管，充分研磨；每管700µL经65℃预热的CTAB提取液，充分混合，65℃水浴30mi弃上清液，用70％乙醇溶液洗涤2遍；室温自然晾干后，加入超纯水或T将种子发芽至幼苗长度达到3cm左右时剪取0.5cm长的幼苗，或将田间植株的叶片剪取0.53扩增产物加入2L上样指示剂后于4℃保存。涂有剥离硅烷的一面朝下盖于无凹槽玻璃板上，两侧对称拔下玻璃板上的样品梳，用清水洗净点样槽，再将玻璃板装上电泳槽，上下槽4针对连锁标记两重PCR扩增产物的检测，若样本量大（多于96个样品），进行两道电泳，即每断开电源，第二次点样96个（包括两个对照样品），2000出，在清水中漂洗1分钟左右；最后取出胶板，晾干，放在胶片观察灯下观察，长度的PCR扩增产物，则可判断检测样品中不含有相应的抗稻瘟病基因；如可扩增出与阳性对照5用TE缓冲液1（或超纯水）分别配制正向A.3.140％PAGE胶6A.3.24％PAGE胶A.3.3亲和硅烷工作液A.3.55×TBE缓冲液A.3.60.5×TBE缓冲液7原浓度终浓度体积ddH2O--10×Buffer10×1×1MgCl225mmol/L2.5mmol/L1dNTP2.5mmol/L0.2mmol/LTaq酶5U/L0.5UP1-1引物5mol/L0.25mol/LP2-1引物5mol/L0.25mol/LDNA2原浓度终浓度体积ddH2O--10×Buffer10×1×1MgCl225mmol/L2.5mmol/L1
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