T∕CHATA 066-2026 预防用重组卡介苗（rBCG）的小鼠结核模型评价技术规范

预防用重组卡介苗(rBCG)的小鼠结核模型评价技术规范2026-08-03发布2026-09-03实施中国防痨协会发布I 1范围 2规范性引用文件 3术语和定义 4缩略语 25小鼠结核模型制备 5.1模型制备 5.2模型验证 6.1疫苗免疫及剂量优化 6.2疫苗免疫原性评价：细胞免疫 46.3疫苗免疫原性评价：体液免疫 47rBCG安全性评价 7.1总则 7.2安全性评价的设计与内容 8rBCG保护性评价 8.1非致死剂量感染模型评价 68.2致死剂量感染模型评价 79生物安全要求 7附录A(资料性)小鼠结核模型制备和验证 附录B(资料性)肺脏、脾脏单细胞分离及FCM染色 附录C(资料性)ELISA方法检测血清IgG 附录D(资料性)安全性评价 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规本文件由中国医学科学院医学实验动物研究所、中国医学科学院病首都医科大学附属北京胸科医院、中国医学科学院医药生物技术1本文件适用于在符合生物安全等级要求的实验室内开展rBCG在小鼠结核模型中的评价。下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489—2008实验室生物安全通用要求GB14925—2023实验动物环境及设施GB/T35892—2018实验动物福利伦理审查指南为预防、控制疾病的发生、流行，用于人体免疫接种，能够诱机体在长期种系进化过程中形成的、与生俱来的非特异性防御能力，由适应性免疫adaptiveimmunity机体在接触特定抗原后产生的、由B淋巴细胞和T淋巴细胞介导的特异性免疫应答，具有抗3.64缩略语ABSL-3:动物生物安全三级实验室(AnimBSL-1:生物安全一级实验室(BiosafetyLevel1Laboratory)GLP:药物非临床研究质量管理规范(GoodLaborSPF:无特定病原体级动物(SpecificPathogenFreeAnimal)3应使用SPF级6周～8周龄小鼠，同一批次实验宜使用同性别小鼠。小鼠随机分组，每组数量应使用Mtb标准菌株(如H37Rv)。菌株培养制备方法详见附录A.1.2。模型制备方法详见附录A.1.3。Mtb感染小鼠后选择合适时间(比如4周),安乐死并解剖小鼠，无菌取出的小鼠肺、脾组织Mtb感染后选择合适时间(比如4周)的小鼠肺、脾组织，观察是否有结核结节样病变。显微镜下观察肺组织有无结核菌感染引起的炎性细胞浸润情况，且抗酸染色能否检测出Mtb;脾脏组织白髓区生发中心是否有不规则破坏等病理改变，详见附录A.3.3。6疫苗免疫原性评价免疫途径：皮下注射为基本途径。若疫苗设计有特殊要求(如黏膜免疫),可根据实际情况rBCG的特异性记忆性T细胞、Th1/Th2免疫反应相关细胞因子、体液免疫的抗体IgG以及淋根据疫苗作用原理选择合适时间进行检测，比如小鼠免疫72小时、1周及4周后采用流式细胞术(FlowCytometry,FCM)分别检测肺、脾脏单细胞悬液中的固有免疫细胞，包括NK细胞、单核细胞、树突状细胞等固有免疫细胞的绝对值及百分比，评价疫苗诱导的早期及后期固有免疫应答。详见附录B。检测各组小鼠初始T细胞、效应T细胞、记忆Th1/Th2/Th17相关细胞因子水平，综合评价rBCG诱导的适应性免疫应答。详见附录B。应将BCG阳性对照组(一般为已上市的标准BCG疫苗)分别与溶媒对照组进行比较，如有统计学差异，证明实验系统稳定可靠；不同剂量rBCG组分别与溶媒对照组、亲本BCG对照组、BCG阳性对照组进行比较，以Th1免疫应答相关指标判定rBCG免疫原性差异，并检验是否具有以Th1免疫反应相关指标(如IFN-y、IL-2)为例，结果判定分为以下两种情况：(1)IFN-y和IL2的表达水平显著升高，与溶媒对照组和亲本BCG对照相比，组间差异具有(2)IFN-γ和IL2的表达无显著差异，与溶媒对照组和亲本BCG对学意义，则rBCG疫苗的特异性免疫原性弱。根据疫苗作用原理选择合适时间进行检测，比如小鼠免疫72小时、1周及4周等时间点，采采用流式细胞术检测B细胞亚群，综合评估rBCG诱导的体液免疫应答。5靠；不同剂量rBCG组分别与溶媒对照组、亲本BCG对照组、BCG阳性对照组进行比较，以IgG抗体水平判定rBCG免疫原性差异，并检验是否具有统计学意义。详见附录C。以C57BL/6小鼠IgG2c/IgG1比值判定(1)IgG2c/IgG1>1,与溶媒对照组和亲本BCG对照组相比差异有统计学意义，提示疫苗以(2)IgG2c/IgG1<1,与溶媒对照组和亲本BCG对照组相比差异有统计学意义，提示疫苗以综合Th1型细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2)、记忆T细胞亚群分布及IgG2c/IgG1比值，全应在符合药物非临床研究质量管理规范(GoodLaborato实验设计、检测指标(如常规指标、血液学指标、病理学指标),详见附录D。(1)感染模型对照组：仅进行病原菌攻毒，不做免疫处理；(2)阴性对照组：给予溶媒或PBS,不进行免疫及攻毒感染；(3)阳性对照组：免疫已上市的标准BCG疫苗后，再进行病原菌攻毒感染；(4)亲本BCG对照：免疫rBCG的亲本疫苗后，再进行病原菌攻毒感染；(5)受试rBCG疫苗组：设置多个梯度剂量的rBCG疫苗免疫组，完成免疫后统一进行病原菌(1)组织荷菌量；详见附录A.2.2。(2)组织病理学检测；详见附录A.3.2和A.3.3。(3)免疫学指标检测，包括记忆性T细胞、Th1/Th2型细胞因子等；详见附录B。将感染模型对照组与阴性对照组进行统计学分析，若两组组织荷菌量、病计学意义，判定感染模型构建成功；再将BCG阳性对照组与感染模型将各剂量rBCG实验组分别与感染模型对照组、亲本BCG对照组、阴性对照组进行统计学分1)荷菌量显著下降、病理损伤明显改善(P<0.05):判定为具有保护作用；4)荷菌量与病理损伤均无显著改变(P≥0.05):判定为无保护作用。对初步判定具备保护作用的rBCG组别，进一步与BCG阳性对照组(已上市的标准BCG疫苗)开展统计学比较：1)各项指标组间无统计学差异：判定rBCG相对市售标准BCG疫苗具有非劣效性；7不同剂量rBCG组、亲本BCG对照、阴性对照或BCG阳性对照(已上市标准BCG)免疫小鼠。免疫时间根据疫苗作用原理确定,比如免疫4周后,通过气溶胶途径给予致死剂量Mtb攻毒。持续记录小鼠存活率与生存时间,并绘制生存曲线。首先进行模型验证:感染模型对照组与阴性对照组相比,存活率、生存时间存在统计学差异,提示模型构建成功;阳性对照组与感染模型对照组相比差异显著,证明试验体系稳定。将各rBCG剂量组分别与感染模型对照组、亲本BCG对照、阴性对照组比较,判定保护效果:1)存活率显著提高、生存时间延长(P<0.05),判定为具有保护作用;将具备保护作用的rBCG组与BCG阳性对照组对比:组间无统计学差异则判定为非劣效;若35892—2018实验动物福利伦理审查指南和中国药典三部(涉及生物制品检定、无菌检查的相关内容)的要求。9.3含菌组织应用不少于10倍体积的10%中性福尔马林固定，固定时间不少于72小时，且确保固定液充分渗透组织内部,经确认灭活后方可转移至BSL-1实验室进行后续处理。本文件涉及的动物实验宜经所在机构实验动物伦理委员会审查批准主要设备：二级生物安全柜A2型或以上、恒温培养箱、分光光度计、肺部液体定量雾化器主要试剂耗材：无菌PBS、中性罗氏培养基或含10%OADC的7H10平板、异氟烷、菌液。A.1.2模型制备选用的菌株及制备方法H37Rv菌株接种于固体培养基(中性罗氏培养基或含10%OADC的7H10),37℃培养3周~4周至菌落成熟后收集。使用玻璃研磨器或组织研磨仪在生物安全柜内进行研磨，操作时避免产生气溶胶。研磨后静置5分钟使大颗粒沉降。然后经5μm滤器过滤，用pH7.2的PBS(0.01稀释涂板，37℃培养3周~4周后计数CFU,确认实际感染剂量。确认结果应在试验记录中注明。1)麻醉使用异氟烷麻醉机2%～5%异氟烷将小鼠麻醉，以小鼠呼吸平稳、无自主活动、无2)感染小鼠仰卧位固定在小动物操作台上，然后把小动物喉镜从小鼠口中放入帮助肺部液体定量雾化器进入小鼠气管将50μLMtb溶液雾化进行气溶胶感染。感染后，将小鼠置于恢复笼中，保持温暖，待完全清醒后放回原饲养笼，密切观察24小时内有无异常反应。主要试剂耗材：中性罗氏培养基或含10%OADC的7H10平板、无菌PBS、涂菌棒、移液91)取组织小鼠感染MtbH37Rv标准株后，选择合适时间(比如4周)对其进行安乐死，无菌取肺组织、脾组织依次在生理盐水、4%H₂SO₄和生理盐水进行漂洗，然后置于预冷的无菌2)研磨使用组织研磨仪充分研磨制备肺组织、脾组织匀浆。3)稀释组织匀浆液连续十倍梯度稀释。5)计数37℃培养，3周后首次观察菌落生长情况，4周后进行终末计数。计数时选取菌落数在30～300之间的稀释梯度进行统计。6)做图并进行统计学分析。主要设备：二级生物安全柜A2型或以上、组织脱水机、石蜡包埋机、石蜡切片机。主要试剂耗材：10%福尔马林、固定缸、载玻片、盖玻片、苏木素-伊红染色液、75%乙醇，85%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、二甲苯、中性树胶。小鼠安乐死后，取出肺脏、脾脏组织，观察组织表面有无结节、肉芽肿样病变，剪开观察组小鼠感染MtbH37Rv标准株后，选择合适时间(比如4周)实施安乐死。取小鼠肺组织、脾组织，将肺组织、脾组织用10%福尔马林固定72小时后从ABSL-3实验室转出到BSL-1实验室。固定液体积应为组织体积的10倍以上，确保固定液充分渗透。随后组织进行脱水、包埋、切片、HE染色。通过显微镜下观察炎性细胞浸润情况，抗酸染色鉴定组织内的Mtb;脾脏白髓区生发中心有无不规则破坏。如果观察到肺实变和脾白髓破坏，抗酸染色可见Mtb,且组织荷菌量提示50mg胶原酶IV溶于100μLHanks溶液中，混匀后以Hanks溶液定容至50mL,终浓度11)肺组织置于10mL胶原酶消化液中，37℃水浴振荡(100rpm～120rpm)消化20分钟~30分钟；3)5mL红细胞裂解液重悬，室温孵育5分钟，加10mLPBS终止，2000rpm离心5分钟，1)通过机械研磨获得单细胞悬液，无需酶消化。脾脏组织置于70μm筛网上进行研磨，获取2)PBS清洗滤网，2000rpm离心5分钟，弃上清；3)5mL红细胞裂解液重悬沉淀，室温孵育5分钟，加10mLPBS终止裂解，2000rpm离心5分钟，弃上清；4)PBS重悬，台盼蓝染色计数，取1×10⁶个活细胞进行流式染色。1)胞内细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10等)检测前需细胞激活刺激：取1×10⁶细胞于培养板中，加入细胞刺激混合物(如PMA50ng/mL、离子霉素1μg/mL)和蛋白转运抑制剂(如布雷菲尔德菌素A或莫能霉素),37℃、5%CO₂孵育4小时~6小时。刺激结束后收集细胞进行3)表面染色后，用固定液室温避光固定30分钟，4℃保存待测。1)取1×10⁶细胞于流式管内；3)[可选步骤]根据实验需求对细胞悬液进行Fc(如抗小鼠CD16/CD32抗体)受体封闭，减4)按照抗体说明书加荧光标记抗体染细胞表面标志分子，4℃避光孵育30分钟；6)加入1mL1×固定缓冲液，涡旋混匀，4℃避光孵育30分钟，1mL1×破膜缓冲液清洗1500rpm离心5分钟，弃上清；7)2mL1×破膜缓冲液重悬细胞，涡旋混匀，4℃避光孵育30分钟，1500rpm离心5分钟，8)按照抗体使用说明书加核内染色抗体，混匀后室温避光孵育30分钟；9)加入2mL1×破膜缓冲液，1500rpm离心5分钟，弃上清；将纯化的Mtb特异性抗原(如结核菌素纯蛋白衍生物，PPD)以1μg/mL用包被缓冲液稀释后，按照100μL/孔加入酶标板孔中，通常4℃孵育12小时～18小时，使抗原吸附在孔底。C.2封闭弃去包被液并洗涤后，加入封闭液300μL/孔(如5%脱脂奶粉/PBS溶液)以封闭孔板上未结合的非特异性位点，减少背景干扰。弃去包被液，用PBST(含0.05%Tween-20的PBS)洗涤3次，每次300μL/孔，静置30秒～60秒后弃去。加入封闭液300μL/孔(如5%脱脂奶粉/PBS溶液或1%BSA/PBS溶液),37℃孵育1小时~2小时或4℃孵育过夜，以封闭孔板上未结合的非特异性位点。根据预实验确定的抗体滴度，使用PBS溶液对血清进行适当稀释(推荐起始稀释倍数为1:100、1:200、1:400等系列稀释)。建议每个样本设置2～3个稀释度，以确保检测值落在标准阴性对照：未免疫小鼠血清(同品系、周龄);阳性对照：以已上市的标准BCG免疫小鼠血清(经ELISA验证为强阳性),分装后-80℃保存，每次实验使用同一批次对照血清。C.4加样加入稀释好的待检血清100μL/孔(以及阴、阳性对照),37℃孵育1小时，建议使用微孔板振荡器低速振荡(300rpm～500rpm)以保证血清中的特异性抗体与固相抗原均匀结合。PBST洗板3次。加入酶(如辣根过氧化物酶，HRP)标记的抗鼠IgG抗体100μL/孔(使用PBS或封闭液按PBST洗板5次，每次300μL/孔，静置30秒～60秒后弃去，最后一次洗涤后在吸水纸上拍C.6显色与终止洗涤后加入酶的底物(如TMB)100μL/孔，室温避光反应10分钟～20分钟，进行显色。以阳性对照孔显色明显(OD₄50值达到1.0～1.5)、阴性对照孔无明显显色为显色终止的判断依据。显色后加入终止液(2mol/LH₂SO₄)50μL/孔终止反应。终止反应后30分钟内完成酶标仪通过与标准曲线比较，计算出样品中目标抗体的浓度。标准曲线是通过使用已知浓度的抗体C.7.1抗体滴度测定(推荐) 如需测定抗体绝对浓度，应使用商品化小鼠IgG标准品建立标准曲线，同时检测待测样本。标准曲线R²≥0.99,待测样本OD₄50值应落在标准曲线线性范围内。1)将BCG阳性对照组(已上市标准BCG)与感染模型对照组、阴性对照组进行比较，若BCG组抗体滴度显著高于对照组(P<0.05),证明实验系统稳定可靠；1)阴性对照孔OD₄50值≤0.10;2)阳性对照孔OD₄50值≥1.00;3)空白孔(无血清、无二抗)OD₄50值≤0.05。(资料性附录)1)一般毒理学研究通常使用已有大量历史对照数据，来源、品系、遗传背景清楚的正常动物开展，通常不需要开展单独的幼龄动物研究。宜选择对疫苗所预防的病2)必要时可选择疾病模型动物开展试验。可根据临床拟用人群确定动物周龄。3)每个剂量每种性别一般不少于15只动物(如主试验组10只，恢复期5只)。1)安全药理学试验通常结合重复给药毒性试验开展。2)可应用小鼠评价疫苗对中枢神经系统和呼吸系统等的影响，检测时间范围应涵盖疫苗的体1)急性毒性信息可在重复给药毒性试验中进行评估，通常不需要开展常规的单次给药毒性试2)重复给药毒性试验的给药次数通常比临床免疫多一次，给药间隔应依据动物体内免疫应答3)研究至少设置两个给药剂量，剂量范围应包括最大人用剂量。4)试验中应重点关注免疫功能指标(包括体液和/或细胞免疫应答检测)、免疫器官的组织5)常规检测指标包括临床症状观察、体重、摄食量、眼科检查、血液学检查、血生化检查等。6)末次给药后，应设置至少4周恢复期，以了解毒性反应的可逆性和可能出现的迟发毒性。分别在给药结束和恢复期结束时进行系统的大体剖检，称重主要脏定主要脏器进行组织病理学检查。需称重并计算脏器系数的器官包括：脑、心脏、肝脏、肾脏、肾上腺、胸腺、脾脏、睾丸、附睾、卵巢、子宫；需要进行组织病理学检查的组织或器官包括：肾上腺、主动脉、骨(股骨)、骨髓(胸骨)、脑(至少3个水平)、盲肠、结肠、子宫和子宫颈、十二指肠、附睾、食管、眼、胆囊、哈氏腺、心脏、回肠、空肠、肾脏、肝脏、肺脏(含主支气管)、淋巴结(一个与给药