ISO 6888-22021Amd 12023 食物链微生物学凝固酶阳性葡萄球菌（金黄色葡萄球菌和其他种类）计数的水平方法第2部分使用兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基的方法修改1标准立项发展报告

食物链微生物学凝固酶阳性葡萄球菌（金黄色葡萄球菌和其他种类）计数的水平方法第2部分：使用兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基的方法修改1StandardizationDevelopmentReport:Microbiologyofthefoodchain—Horizontalmethodfortheenumerationofcoagulase-positivestaphylococci(Staphylococcusaureusandotherspecies)—Part2:Methodusingrabbitplasmafibrinogenagarmedium—Amendment1摘要食品安全是公共卫生领域的核心议题，而凝固酶阳性葡萄球菌（包括金黄色葡萄球菌及其他相关菌种）作为引发食源性疾病的重要病原微生物，其准确、高效的检测与计数方法在全球食品安全监管体系中占据关键地位。国际标准ISO6888-2:2021规定了采用兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基对食物链中凝固酶阳性葡萄球菌进行水平计数的方法，而ISO6888-2:2021/Amd1:2023作为该标准的修改1，于2023年9月发布，对原标准中的关键技术环节进行了修订完善。本报告系统梳理了该修改单的立项背景、技术内容、修订要点及其对食品微生物检测领域的深远影响。报告指出，该修改单的发布进一步提升了凝固酶阳性葡萄球菌检测方法的准确性、可重复性和实验室间可比性，回应了食品微生物检测技术发展的最新需求，对完善我国食品安全标准体系、促进食品国际贸易具有重要的参考价值和指导意义。关键词：凝固酶阳性葡萄球菌；金黄色葡萄球菌；兔血浆纤维蛋白原琼脂；食品微生物学；国际标准修改；水平计数方法；食品安全检测Keywords:Coagulase-positivestaphylococci;Staphylococcusaureus;Rabbitplasmafibrinogenagar;Foodmicrobiology;Internationalstandardamendment;Horizontalenumerationmethod;Foodsafetytesting1引言1.1研究背景食品安全是关系人民群众身体健康和生命安全的重要民生问题。世界卫生组织（WHO）数据显示，全球每年约有6亿人因食用受污染的食品而生病，其中约42万人死亡。在众多食源性致病微生物中，凝固酶阳性葡萄球菌（Coagulase-positivestaphylococci,CPS）是一类不可忽视的重要病原菌群，其代表性菌种——金黄色葡萄球菌（*Staphylococcusaureus*）——是引发细菌性食物中毒的常见病原体之一。金黄色葡萄球菌广泛分布于自然界中，可在食品加工、储存和流通的各环节污染食品。其在适宜条件下可产生多种肠毒素，其中以A型和B型肠毒素最为常见，人体摄入含足量肠毒素的污染食品后，经过1至6小时的潜伏期即出现恶心、剧烈呕吐、腹痛、腹泻等急性胃肠炎症状。由于金黄色葡萄球菌在食品中的污染具有普遍性和隐蔽性，建立准确、标准化的检测和计数方法对于保障食品安全至关重要。1.2标准修订的必要性ISO6888-2标准是国际食品微生物检测领域公认的权威方法标准，其第2部分规定了采用兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基（RPFA）对凝固酶阳性葡萄球菌进行计数的水平方法。该标准在全球范围内被广泛采用，是各国食品安全监管机构、食品生产企业及第三方检测实验室开展相关检测工作的重要技术依据。然而，随着食品微生物检测技术的持续进步和行业实践经验的不断积累，原标准中的部分技术内容已不能完全满足当前检测工作的实际需求。具体而言，检测人员在长期应用过程中发现，部分环节的操作细节有待进一步明确，某些试验条件对特定类型食品基质的适用性存在改进空间。此外，实验室间比对研究（interlaboratorystudies）的结果也揭示了不同实验室在执行原标准时可能出现的结果偏差，这在一定程度上影响了检测结果的可比性和一致性。在上述背景下，国际标准化组织食品委员会（ISO/TC34）下属的食品微生物学分技术委员会（SC9）组织相关国际专家对ISO6888-2:2021进行了系统评审和修订，最终形成了ISO6888-2:2021/Amd1:2023修改单。该修改单的发布实施，是国际食品微生物检测标准体系持续完善的重要体现。1.3标准基本信息本报告所涉修改单的标准编号为ISO6888-2:2021/Amd1:2023，由国际标准化组织（ISO）于2023年9月12日正式发布。该标准归属于ISO/TC34/SC9（食品微生物学分技术委员会）归口管理，标准类别为食品微生物学检测方法标准，现行有效。标准原文以英语发布，可供全球各成员国直接采用或转化为本国标准。2标准技术内容概述2.1标准适用范围ISO6888-2标准适用于食品和动物饲料中凝固酶阳性葡萄球菌（包括金黄色葡萄球菌和其他凝固酶阳性菌种）的水平计数。该方法采用兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基（RabbitPlasmaFibrinogenAgar,RPFA），通过特定的培养条件和菌落特征识别实现对目标菌的计数。该标准作为水平方法（horizontalmethod），其设计原则是尽可能适用于各类食品基质，包括但不限于肉及肉制品、乳及乳制品、水产品、即食食品、婴幼儿食品等。2.2方法原理ISO6888-2所规定的检测方法基于以下核心原理：将适当稀释度的样品悬浮液接种于兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基表面，在35~37℃条件下需氧培养24~48小时。凝固酶阳性葡萄球菌在该培养基上生长时，其产生的凝固酶可使培养基中的兔血浆纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白，从而在菌落周围形成特征性的不透明晕圈（opacityzone）。检测人员依据典型菌落形态（黑色或灰黑色菌落周围环绕不透明沉淀环）进行计数，必要时通过凝固酶试验等确认试验对可疑菌落进行验证。2.3修改1（Amendment1）的主要修订内容ISO6888-2:2021/Amd1:2023修改单对原标准进行了技术性修订，主要涉及以下几个关键方面：（1）培养基成分和制备方法的优化。修改单对兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基中某些组分的含量范围进行了调整，旨在提高培养基的选择性和灵敏度。同时，对培养基的配制步骤和灭菌条件提供了更为明确的操作指引，以减少不同实验室之间在该环节产生的差异。（2）接种和培养条件的细化。修改单对样品接种量、接种方式（倾注法或表面涂布法）以及培养温度、时间和湿度条件进行了进一步明确和优化，以增强方法对不同食品基质的适用性和结果的重复性。（3）菌落计数规则的完善。修改单对可疑菌落的确认和计数规则提供了更为清晰的表述，特别是在处理典型菌落与非典型菌落共存、菌落过度生长或融合等情况时，给出了更具操作性的指导原则。（4）精密度数据的更新。修改单补充和更新了基于国际实验室间协同试验获得的精密度数据（重复性限和再现性限），使标准使用者能够更准确地评估本实验室检测结果的可靠性和可比性。（5）编辑性和规范性修订。修改单对标准文本中的若干术语定义、引用文献和附录内容进行了编辑性修订，以确保标准内容的准确性和与其他相关标准（如ISO6888-1、ISO7218等）的一致性。2.4标准的地位和作用ISO6888-2在国际食品微生物检测标准体系中具有举足轻重的地位。该标准与ISO6888-1（采用Baird-Parker琼脂培养基的计数方法）共同构成了凝固酶阳性葡萄球菌计数的两大平行方法，使用者可根据实验室条件和样品特性选择适宜的方法。作为国际食品微生物规格标准（如ICMSF的微生物标准）中相关限量的配套检测方法，ISO6888-2在食品安全国际贸易中发挥着基础性技术支撑作用。3标准修订的国内外背景3.1国际食品微生物检测技术的发展趋势近年来，食品微生物检测技术呈现出快速发展的态势，主要体现在以下几个方面：分子生物学方法（如实时荧光定量PCR、等温核酸扩增技术等）在快速筛查领域日益普及；自动化检测系统和生物传感器技术不断推陈出新；培养法作为经典的确证方法，其标准化和精细化程度持续提升。在此背景下，传统培养计数方法在保持其“金标准”地位的同时，也面临着持续优化和完善的内在需求。ISO/TC34/SC9作为国际食品微生物检测标准制定的核心机构，长期致力于推动检测方法的国际标准化和协调一致。其制定的标准体系涵盖了食品微生物检测的各个层面，包括水平方法标准、特定基质方法标准、分子生物学检测标准以及实验室质量控制标准等。本修改单的出台，正是该技术委员会持续开展标准维护和更新工作的成果之一。3.2我国食品微生物检测标准体系的对接需求我国高度重视食品安全标准化工作。目前，我国已建立了以GB4789系列标准为核心的食品微生物学检验标准体系。在凝固酶阳性葡萄球菌计数方面，我国现行有效的国家标准为GB4789.10-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》，该标准等效采用了ISO6888系列标准的技术内容，规定了金黄色葡萄球菌的定性检验和定量计数方法，其中定量计数方法包括Baird-Parker平板计数法和兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基计数法。随着ISO6888-2:2021/Amd1:2023修改单的发布，我国相关标准化技术机构需要及时跟踪国际标准的最新动态，评估修订内容对我国现行标准的影响，适时开展国家标准的修订或补充工作，以确保我国食品微生物检测方法标准与国际标准保持同步和协调。3.3食品行业和相关方的实际需求4主要修订内容详析4.1培养基性能要求的强化兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基是本方法的核心要素之一，其质量直接决定了检测结果的准确性。修改单在培养基方面主要从以下三个方面进行了强化：其一，明确了兔血浆纤维蛋白原的质量验收标准。由于兔血浆的来源、抗凝处理方式、纤维蛋白原含量等因素均可影响培养基的选择性和灵敏度，修改单对验收试验的具体操作和判定标准进行了补充说明，要求每批新配制的培养基均需使用参考菌株进行性能验证。其二，优化了培养基中补充剂（如磺胺嘧啶钾、多粘菌素B等选择性抑菌成分）的添加量和添加方式。通过合理的配方调整，在不影响目标菌回收率的前提下，提高了培养基对背景菌群的抑制效果。其三，补充了培养基配制和保存过程中的注意事项，包括配制用水的水质要求、加热溶解的温度和时间控制、培养基的冷却方式和保存期限等。这些细节性规定有助于减少因操作不当导致的培养基质量波动。4.2操作流程的精细化调整在样品处理和接种环节，修改单提供了一系列更为明确和可操作的技术指引。具体而言，在样品均质方面，明确了均质时间和速度的推荐范围，以确保样品中目标菌的有效释放；在稀释液选择方面，根据样品类型的不同，规范了缓冲蛋白胨水（BPW）、0.1%蛋白胨水等稀释液的使用原则；在接种量方面，明确了每一稀释度接种到两块平板的体积分配方式。与此同时，修改单充分关注了食品基质多样性对检测方法适用性的影响。考虑到不同食品基质（如高盐食品、高脂食品、低水分活度食品等）中凝固酶阳性葡萄球菌的生理状态可能不同，修改单在培养条件方面提供了适度的灵活性，允许实验室在一定范围内调整培养条件，但需进行相应的方法验证，并将验证记录纳入质量管理体系文件。这一安排既保证了方法的标准化水平，又兼顾了实际检测工作的灵活性需求。4.3结果报告方式的明确在结果计算和报告方面，修改单对菌落计数的有效数字修约规则、不同稀释度计数结果的加权计算方式、以及低于检测限（如<10CFU/g）和高于计数上限时的结果报告方式等，均提供了更为明确的技术指引。这些规定有助于减少不同实验室在结果表达环节的差异，提高检测数据的规范性和可比性。4.4质量控制要求的提升修改单进一步强化了实验室内部质量控制的有关要求。除了常规的空白对照、阳性对照和阴性对照外，修改单鼓励实验室在每批样品检测时同步开展加标回收试验（spikerecoverytest），以持续监测和评估方法在本实验室条件下的回收率和检测效能。同时，修改单呼应了ISO7218（食品和动物饲料微生物检验的一般要求和指南）中的有关质量控制原则，强调了培养基质量验证、设备校准和人员能力确认等在保障检测结果可靠性方面的重要性。5标准修订的预期影响5.1对检测准确性和可比性的改善通过上述技术修订，ISO6888-2:2021/Amd1:2023有望在多个维度上改善凝固酶阳性葡萄球菌计数检测的性能表现。首先，培养基配方的优化和验收标准的明确，将直接提高目标菌的回收率和选择性，减少假阴性和假阳性结果的发生概率。其次，操作流程的精细化调整有助于减少不同操作人员和不同实验室之间的操作变异性，从而提高检测结果的重复性和再现性。最后，精密度数据的更新为标准使用者提供了更为准确的测量不确定度评估依据，有助于更科学地解读和比较检测结果。5.2对国际贸易和技术协调的促进食品国际贸易对检测方法的国际互认提出了很高的要求。ISO标准作为国际通行的技术规则，其不同版本之间如果存在较大的技术差异，可能给国际贸易中的检验互认带来障碍。本修改单的发布实施，为各成员国提供了一个更新、更完善的技术参照，有助于各国在检测方法和结果判定方面保持协调一致，减少技术性贸易壁垒。5.3对我国标准体系建设的启示我国食品微生物学检验标准体系虽然已形成了较为完整的架构，但在标准更新速度、精密度数据积累、方法适用性验证等方面仍存在一定的提升空间。ISO6888-2修改单的发布，给我国标准化工作提供了有益的启示：一是需加强国际标准跟踪和评估机制建设，及时识别和评估国际标准修订对我国标准体系和检测实践的影响；二是需重视实验室间协同试验数据的系统积累，为标准修订提供充分的技术数据支撑；三是需关注新兴检测技术与传统培养方法的协同应用，推动标准体系的持续优化和升级。6主要参与单位和机构6.1国际标准化组织食品技术委员会（ISO/TC34）ISO/TC34是国际标准化组织下设的负责食品领域标准制定的技术委员会，成立于1947年，秘书处目前由法国标准化协会（AFNOR）承担。该委员会的工作范围涵盖农产食品的术语、取样、检验和分析方法、产品质量规格、包装和储存要求等广泛领域，其制定的标准在全球食品贸易和食品安全监管中发挥着基础性作用。ISO/TC34的组织架构中，与食品微生物学检测相关的技术工作主要由其第9分技术委员会（SC9）——“食品微生物学”分技术委员会承担。SC9负责制定和修订食品和动物饲料微生物检验领域的水平方法标准、专用方法标准和相关指南文件，其工作成果构成了国际食品微生物检测标准体系的核心内容。SC9的主席和秘书处分别由荷兰和法国的专家和标准化机构承担，委员来自世界各国的标准化机构、科研院校、检测机构和行业组织。在ISO6888-2:2021/Amd1:2023的修订工作中，SC9专门成立了工作组（WG），汇集了来自多个成员体的微生物学专家和标准化专家。工作组在充分收集各成员体使用反馈和实验室间协同试验数据的基础上，经过多轮讨论和磋商，最终达成了修改单的技术内容共识。该修改单的形成，充分体现了ISO标准制定过程中科学性和协商一致性的基本原则。6.2国际食品微生物规格委员会（ICMSF）国际食品微生物规格委员会（InternationalCommissiononMicrobiologicalSpecificationsforFoods,ICMSF）作为联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）联合设立的国际食品微生物标准咨询机构，长期致力于食品微生物风险评估和微生物标准制定。虽然ICMSF不直接参与ISO标准的制定，但其出版的微生物标准指南和食品微生物生态学系列著作，为包括ISO6888-2在内的诸多国际标准提供了重要的科学基础。ICMSF在其第2版《食品微生物学——检测与规格的公共卫生意义》（Microorg