ISO 11737-32023 卫生保健产品的灭菌.微生物学方法.第3部分细菌内毒素检验标准立项发展报告

卫生保健产品的灭菌微生物学方法第3部分：细菌内毒素检验标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:Sterilizationofhealthcareproducts—Microbiologicalmethods—Part3:Bacterialendotoxintesting摘要关键词：细菌内毒素；鲎试剂；灭菌；微生物学方法；国际标准；热原检测；质量控制Keywords:Bacterialendotoxin;LALreagent;Sterilization;Microbiologicalmethods;Internationalstandard;Pyrogentesting;Qualitycontrol一、引言1.1研究背景内毒素（Endotoxin）又称脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS），是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的特征性组分。当细菌死亡或裂解时，内毒素被大量释放至周围环境中。与大多数细菌毒素不同，内毒素具有极高的热稳定性，常规灭菌手段难以将其彻底灭活。人体对内毒素极为敏感，极微量（每千克体重5EU）的内毒素进入血液循环即可引起内毒素血症，表现为发热、寒战、白细胞减少、弥散性血管内凝血甚至感染性休克。因此，世界各国药品监管机构均对内毒素限量做出严格规定，要求所有注射类药品、医疗器械及生物制品在出厂前必须通过内毒素检测。传统上，细菌内毒素检测主要依赖鲎试剂法，包括凝胶法、浊度法和显色基质法。该方法灵敏度高、操作相对简便，已被《美国药典》《欧洲药典》《中国药典》等主要药典体系广泛收载。然而，随着生物制药产业的高速发展，内毒素检测面临的样本基质日趋复杂——细胞治疗产品、基因治疗载体、纳米制剂等新型药物不断涌现，传统鲎试剂法在某些复杂基质中可能出现增强或抑制干扰；同时，重组因子C方法等非动物源性替代技术日趋成熟，对现有标准体系提出新的需求。在此背景下，ISO/TC198（卫生保健产品灭菌技术委员会）下属工作组对ISO11737-3进行了系统修订。ISO11737-3的上一版本发布于2004年（基于EN11737-3:2004转化），已无法充分覆盖近年来内毒素检测领域的技术进展和监管需求。历经多轮国际讨论和草案修订，ISO11737-3:2023最终于2023年6月正式发布，取代了旧版标准。1.2标准基本信息|项目|内容||------|------||标准编号|ISO11737-3:2023||标准名称|卫生保健产品的灭菌微生物学方法第3部分：细菌内毒素检验||英文名称|Sterilizationofhealthcareproducts—Microbiologicalmethods—Part3:Bacterialendotoxintesting||标准状态|现行||发布机构|国际标准化组织（ISO）||技术委员会|ISO/TC198（卫生保健产品灭菌）||发布日期|2023年6月26日||替代标准|ISO11737-3:2004||分类号|消毒和灭菌综合||国别|国际组织||语言|英语||ICS分类|11.080.01|二、标准编制历程与立项背景2.1标准体系概述ISO11737系列标准是国际卫生保健产品灭菌验证领域最重要的基础性标准系列之一，由ISO/TC198负责制定。该系列标准共分为三个部分：-ISO11737-1：微生物学方法第1部分：产品上微生物总数的测定-ISO11737-2：微生物学方法第2部分：无菌试验-ISO11737-3：微生物学方法第3部分：细菌内毒素检验ISO11737-3主要关注灭菌后卫生保健产品中细菌内毒素的检验方法，与ISO11737-1（生物负载测定）和ISO11737-2（无菌检验）共同构成卫生保健产品微生物安全性评价的完整技术链条。2.2前版标准回顾ISO11737-3:2004（即EN11737-3:2004）是欧洲标准化委员会（CEN）与国际标准化组织（ISO）在“维也纳协定”框架下合作制定的标准。该版本主要规定了以下内容：-细菌内毒素检验的通用要求-凝胶法（Gel-clottechnique）的技术规范-光度法（Photometrictechnique，包括浊度法和显色法）的技术规范-内毒素限值的设定原则-干扰试验的基本框架然而，该版本已发布近二十年，在以下方面存在明显不足：1.技术覆盖不全：未能涵盖近年来发展迅速的重组因子C（rFC）方法等替代技术；2.样本适用性有限：对医疗器械浸提液、细胞治疗产品等复杂基质的指导不够具体；3.质量风险管理要素缺失：未充分引入ICHQ9质量风险管理理念和ICHQ14分析方法验证要求；4.与药典体系衔接不足：各国药典在内毒素检测方面的更新未能及时反映。2.3修订立项依据ISO/TC198在系统评估上述问题后，于2018年前后正式启动ISO11737-3的修订立项工作。立项依据主要包括：1.技术发展驱动力：重组因子C方法、微流控芯片检测技术等新型检测平台的成熟度日益提高，需要标准层面提供验证和实施框架；2.产业需求牵引：生物制品、细胞与基因治疗产品等高附加值产品的快速发展，对内毒素检测的灵敏度和特异性提出更高要求；3.国际协调需求：世界卫生组织（WHO）和各国药典机构对内毒素检测方法的更新，要求ISO标准保持同步；4.风险管理导向：国际医疗器械监管者论坛（IMDRF）和ISO14971风险管理标准的要求，需要在微生物检测领域引入更系统的风险评估方法。2.4编制过程ISO11737-3:2023的修订过程历时约五年，经历了以下主要阶段：-工作草案（WD）阶段：由ISO/TC198/WG2工作组（微生物方法工作组）负责起草，收集各成员国和联络组织的意见；-委员会草案（CD）阶段：分发至各成员国征求意见，汇总处理意见并形成CD稿；-国际标准草案（DIS）阶段：经过全体成员国投票表决，获得绝大多数支持；-最终国际标准草案（FDIS）阶段：经过最终审查后形成FDIS稿；-正式发布：2023年6月26日正式发布。在编制过程中，美国、日本、英国、德国、中国等主要成员国均深度参与，各国药典机构（如USP、JP、EP）和行业组织也以联络组织身份提供了大量技术输入。三、标准主要内容3.1适用范围ISO11737-3:2023适用于卫生保健产品（包括医疗器械、药品包装、生物制品等）中细菌内毒素的检验。该标准适用于：-经过灭菌处理的卫生保健产品的内毒素检验；-产品原材料、组件及最终产品的内毒素质量评价；-灭菌工艺对内毒素去除/灭活效果的验证。3.2规范性引用文件该标准主要引用了以下关键规范性文件：-ISO11135（环氧乙烷灭菌）、ISO11137（辐射灭菌）、ISO17665（湿热灭菌）等灭菌工艺标准；-ISO14971（医疗器械风险管理）；-ISO/IEC17025（检测和校准实验室能力的通用要求）；-各国药典中关于细菌内毒素检测的通则。3.3核心术语和定义该标准对以下核心术语进行了明确定义：-细菌内毒素（Bacterialendotoxin）：革兰氏阴性菌细胞壁外膜中的脂多糖成分及其相关物质；-内毒素限值（Endotoxinlimit）：产品允许的最大内毒素含量，通常以EU/件、EU/mL或EU/mg表示；-鲎试剂（LALreagent）：由美洲鲎（*Limuluspolyphemus*）或东方鲎（*Tachypleustridentatus*）的变形细胞裂解物制备的试剂；-干扰试验（Interferencetest）：用于确认供试品在特定稀释倍数下不影响内毒素检出的试验；-最大有效稀释倍数（MaximumValidDilution,MVD）：供试品在不产生干扰的前提下允许的最大稀释倍数。3.4方法分类与技术框架ISO11737-3:2023将细菌内毒素检测方法分为两大类：（1）基于鲎试剂的方法（LAL-basedmethods）-凝胶法（Gel-clottechnique）：定性和半定量方法，通过观察凝胶形成判定内毒素含量是否低于检测限。该方法是目前各国药典中最广泛使用的方法，适用于常规质量控制。-光度法（Photometrictechniques）：-*浊度法（Turbidimetricmethod）*：包括动态浊度法和终点浊度法，基于内毒素与鲎试剂反应引起的浊度变化进行定量测定；-*显色基质法（Chromogenicmethod）*：包括动态显色法和终点显色法，基于合成显色底物释放对硝基苯胺（pNA）的显色反应进行定量测定。（2）替代方法（Alternativemethods）-重组因子C方法（RecombinantFactorC,rFC）：利用基因工程表达的鲎因子C替代天然鲎试剂中的因子C，避免了天然鲎资源消耗及批次间差异问题。该方法是近年来发展最快的内毒素检测替代技术。-其他方法：包括基于微流控芯片的检测系统、基于ELISA原理的内毒素检测等。3.5关键操作规范该标准在以下几个关键操作环节提供了详细的技术指导：（1）供试品的制备-明确规定了不同种类产品（固体、液体、医疗器械、生物制品等）的供试品制备方法；-对医疗器械规定了浸提条件（浸提介质、温度、时间）的选择原则；-强调了在样品制备过程中避免外源性内毒素污染的操作要求。（2）内毒素限值的设定-提供了基于产品给药途径、最大人用剂量等参数计算内毒素限值的公式和方法；-参考各国药典和WHO指南，给出了不同给药途径的内毒素限值参考范围；-强调了限值设定应结合风险管理的原则。（3）干扰试验-详细规定了干扰试验的设计方案、操作步骤和结果判定标准；-明确了当供试品存在干扰时需采取的解决措施（如稀释、中和、超滤等）；-引入了“最大有效稀释倍数（MVD）”和“最低有效稀释倍数（LVD）”的概念和应用方法。（4）方法验证-要求在使用替代方法时必须进行充分的方法验证，包括专属性、检测限、定量限、线性、精密度、准确度等参数的验证；-建议参照ICHQ2（分析方法验证）和ISO/IEC17025的要求进行验证。（5）质量控制和统计-对标准曲线、阳性对照、阴性对照、样品平行测定等质量控制要素做了明确规定；-引入了统计学方法对检测结果进行评价，包括回收率计算、置信区间分析等。3.6主要技术变化与ISO11737-3:2004相比，ISO11737-3:2023的主要技术变化包括：|技术领域|2004版本|2023版本||---------|---------|---------||替代方法|未涉及|新增重组因子C等替代方法的验证框架||干扰试验|规定较为简略|细化操作流程和判定标准，引入MVD/LVD概念||内毒素限值设定|参考药典为主|提供系统计算方法，强调风险管理||方法验证|未做系统性要求|全面引入方法验证的理念和要求||供试品制备|一般性原则|针对不同产品类型提供更细化的指导||统计方法|基本统计描述|引入更系统的统计评价方法||风险管理|未纳入|贯穿标准全文的核心理念|四、主要参与单位——ISO/TC198技术委员会介绍4.1ISO/TC198概述ISO/TC198（卫生保健产品灭菌技术委员会）成立于1990年代初，是国际标准化组织下设的专门负责卫生保健产品灭菌领域标准制定的技术委员会。其秘书处设在美国国家标准学会（ANSI），目前由美国担任主席国。截至2024年，ISO/TC198共有参与成员国（P成员）22个，观察成员国（O成员）16个，范围覆盖医疗器械、药品包装、生物制品等各类卫生保健产品的灭菌技术标准。4.2组织架构与分工ISO/TC198下设多个工作组（WG），各司其职：|工作组编号|工作领域||-----------|---------||WG1|灭菌工艺的确认和常规控制||WG2|微生物学方法||WG3|无菌加工||WG4|包装||WG5|生物指示物||WG6|辐射灭菌||WG7|环氧乙烷灭菌||WG8|蒸汽灭菌|ISO11737-3:2023由WG2（微生物学方法）负责编制。WG2的召集人由英国专家担任，工作组汇聚了来自全球的微生物学专家、药品监管机构代表、检测实验室技术负责人和产业界专业人士。在ISO11737-3:2023的编制过程中，WG2先后组织了十余次国际工作会议和多次在线技术讨论，充分平衡了各方意见和利益诉求。4.3主要贡献与工作成果ISO/TC198自成立以来，已经制定并发布了50余项国际标准，构成了卫生保健产品灭菌领域最完整的国际标准体系。代表性标准包括：-ISO11135：环氧乙烷灭菌的确认和常规控制-ISO11137：辐射灭菌（含三个部分）-ISO17665：湿热灭菌-ISO13408：无菌加工（系列标准）-ISO11138：生物指示物（系列标准）-ISO11737：微生物学方法（共三个部分）这些标准被世界各国的监管机构广泛引用，成为医疗器械和药品灭菌领域的“国际通用语言”。4.4在ISO11737-3:2023编制中的角色具体到ISO11737-3:2023，ISO/TC198/WG2在标准编制中承担了以下核心任务：1.需求调研与立项论证：开展全球调研，了解各成员国和产业界对前版标准的修订需求；2.草案编制与修改：组织多轮技术讨论，逐步完善标准的技术内容；3.国际协调：与ISO/TC76（药品及其相关材料的转移和包装）、ISO/TC194（医疗器械生物学评价）等相关技术委员会进行协调，确保标准间的衔接一致性；4.意见处理：系统处理DIS阶段收到的数百条来自各成员国的技术意见，逐条讨论并做出合理裁决；5.发布与推广：组织标准发布后的技术解读和宣贯推广工作。截至2023年底，I