DB15T 4446-2026苹果潜隐病毒鉴定技术规程

ICS65.020.01152026-06-15发布DB15/T4446—2026I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。本文件由内蒙古自治区果蔬标准化技术委员会（SAM/TC25）归口。本文件起草单位：内蒙古农业大学、内蒙古自治区农牧业技术推广中心、中国农业科学院果树研究所、呼和浩特海关、开鲁县农业技术推广中心、内蒙古嘉仕农业科技发展有限公司、内蒙古果计划食品科技发展有限公司。本文件主要起草人：张磊、李正男、孙平平、钟延平、范旭东、郭孟泽、冯永胜、刘庆岩、朱元昌、云铁柱。DB15/T4446—20261苹果潜隐病毒鉴定技术规程本文件规定了苹果褪绿叶斑病毒、苹果茎沟病毒以及苹果茎痘病毒的取样、鉴定方法和判定规则等本文件适用于苹果潜隐病毒的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T34265Sanger法测序技术指南GB/T40974核酸样本质量评价方法SN/T2497.21进出口危险化学品安全试验方法第21部分：琼脂糖凝胶电泳试验3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1苹果潜隐病applelatentvirus一类侵染苹果树后不表现明显外部病征的病毒。在大多数商用苹果品种中，潜隐病毒会削弱树体、降低产量和果实质量，但其病征不易被直观观察。3.2苹果褪绿叶斑病毒applechloroticleafspotvirus（ACLSV）一种正单链RNA病毒，苹果“高接病”的主要病原之一，还引起梨环纹花叶病、李痘病、李假痘病、李裂皮病、杏环斑病及樱桃环斑病，造成果树的生长衰退和减产。3.3苹果茎沟病毒applestemgroovingvirus（ASGV）一种正单链RNA病毒，苹果“高接病”的主要病原之一，感病接穗嫁接到敏感砧木上可造成木质部凹陷、韧皮部坏死和生长衰退。3.4苹果茎痘病毒applestempittingvirus（ASPV）一种正单链RNA病毒，苹果“高接病”的主要病原之一，侵染“弗吉尼亚”小苹果可造成木质部产生痘斑，或出现叶片畸形和树势衰退症状。4检测范围苹果潜隐病毒检测范围主要为苹果、梨、沙梨、榅桲、桃、李、杏、樱桃、花楸以及山楂。DB15/T4446—202625取样5.1取样时间于植株新梢生长旺盛的时期进行取样，避免在植株休眠期采集。5.2取样部位疑似病毒感染的植株，症状表现如叶片花叶、黄化、坏死、畸形等，采集植株幼嫩茎叶，置于自封袋内。对于未表现明显症状的植株，应随机选取不同方位的幼嫩茎叶，置于自封袋内。5.3样品保存样品置于4℃条件下保存，应在24h内完成检测。样品置于-20℃条件下保存，应在7d内完成检测。样品经液氮预冷后，置于-80℃条件下长期保存。6检测方法6.1样品核酸提取选择市售的用于提取含有多糖多酚材料RNA的试剂盒，按照试剂盒自带的说明书进行操作。核酸质量评价按照GB/T40974执行。6.2反转录以提取的质量合格的总RNA为模板，选择市售的具有基因组DNA去除功能的反转录试剂盒进行反转录，合成cDNA。反应体系和反应程序按照试剂盒自带的说明书进行设置。6.3PCR扩增6.3.1PCR反应体系市售产品通常为预混液或单品，根据所选产品提供的说明书，进行PCR反应混合物配制，并按说明书指示加入检测苹果褪绿叶斑病毒、苹果茎沟病毒或苹果茎痘病毒的引物以及cDNA模板。各种病毒的特异性检测引物见表1。表1用于检测三种苹果潜隐病毒的特异性引物引物序列5’-3’ACLSV26FATCGCAGAAGGGGATATTCCAACLSV27RASGV24FATGAGTTTGGAAGACGTGCTTASGV25RASPV22FASPV23RGAAAATCTAGTTAAAACAAAADB15/T4446—202636.3.2PCR反应程序95℃预变性2min。35个反应循环：95℃变性20s；退火20s，退火温度按引物合成报告设置，两个引物退火温度不一致时，取较低温度；72℃延伸，延伸时间根据所选产品说明书提供的参数进行计算。最后，72℃终延伸5min。6.4琼脂糖凝胶电泳检测6.4.1琼脂糖凝胶制备用Tris-乙酸缓冲液溶解琼脂糖，制备质量体积比为1%的琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶的制备按照SN/T2497.21执行。6.4.2电泳检测用Tris-乙酸缓冲液，在水平板电泳槽中进行电泳。上样、电泳按照SN/T2497.21执行。电泳结束时，凝胶置于紫外灯或凝胶成像系统进行观测和拍照，获取的图片用于结果判定。7结果判定待检样品若出现与表1预期大小一致且清晰、位置正确的条带，应判为阳性；若未出现该条带或位置不符，则判为阴性。当阳性对照无预期条带，或阴性对照、空白对照出现预期条带时，检测结果无效，应重新进行RT-PCR检测。8结果验证当不具备阳性对照，只有阴性对照时，应当随机选取3～5个被判定为阳性的样品，对扩增的DNA片段进行序列测定，序列测定按照GB/T34265执行，根据序列