GB 4789.40-2024 食品安全国家标准　食品微生物学检验　克罗诺杆菌检验标准立项发展报告

食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌检验标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:NationalFoodSafetyStandard—FoodMicrobiologyTesting—DetectionofCronobacterSpecies摘要克罗诺杆菌（*Cronobacter*spp.）是一类可引起新生儿脑膜炎、败血症及坏死性小肠结肠炎的条件致病菌，对婴幼儿配方食品的安全构成严重威胁。随着全球范围内由克罗诺杆菌污染引发的食品安全事件屡有发生，建立科学、灵敏、高效的检验标准成为保障婴幼儿食品质量安全的关键技术支撑。本报告围绕国家标准GB4789.40-2024《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌检验》的立项背景、技术内容、修订历程和实施意义进行系统阐述。该标准于2024年2月8日由国家卫生健康委员会发布，2024年8月8日正式实施，替代了原有的GB4789.40-2016版本。新版标准在分子生物学检测技术应用、前增菌与增菌程序优化、菌种鉴定流程完善等方面进行了全面修订，进一步提升了方法的灵敏度、特异性和可操作性，同时与国际食品法典委员会（CAC）及国际标准化组织（ISO）相关标准保持高度协调。本报告还重点介绍了标准主要起草单位之一——中国食品药品检定研究院在标准研制过程中的技术贡献。该标准的发布实施对于完善我国食品安全标准体系、提升婴幼儿配方食品微生物安全控制水平、促进国际贸易具有重要的现实意义。关键词：克罗诺杆菌；食品安全国家标准；微生物检验；婴幼儿配方食品；分子生物学检测；标准修订Keywords:Cronobacter;NationalFoodSafetyStandard;MicrobiologicalTesting;InfantFormula;MolecularDetection;StandardRevision一、引言1.1立项背景克罗诺杆菌属（*Cronobacter*spp.）原称阪崎肠杆菌（*Enterobactersakazakii*），2007年由Iversen等人依据多相分类学方法重新划分为独立菌属。该菌为革兰氏阴性、兼性厌氧的杆状细菌，广泛存在于干燥环境和食品原料中，具有较强的耐热性、耐渗透压性和耐干燥能力，能够在婴幼儿配方奶粉等低水分食品中长期存活。流行病学调查表明，克罗诺杆菌感染主要累及新生儿和免疫功能低下的婴幼儿，临床表现为坏死性小肠结肠炎、菌血症和脑膜炎，病死率可高达40%~80%。尽管感染案例并不常见，但后果极为严重，因此被国际食品微生物规格委员会（ICMSF）列为"严重危害特定人群、危及生命"的致病菌。世界卫生组织（WHO）和联合国粮食及农业组织（FAO）多次发布克罗诺杆菌风险评估报告，敦促各国加强对婴幼儿配方食品中该菌的监控。在此背景下，建立一套与国际接轨、灵敏可靠的克罗诺杆菌检验标准，对于保障我国婴幼儿配方食品的微生物安全具有重大意义，也是完善国家食品安全标准体系、落实"最严谨的标准"要求的必要举措。1.2标准修订的必要性原GB4789.40-2016标准实施以来，在食品微生物检验领域发挥了重要作用，但面对食品安全监管需求的不断提升和检测技术的快速发展，原有标准逐渐暴露出以下不足：（1）检测周期较长：传统方法需经过预增菌、增菌、分离培养、生化鉴定等多个环节，从样品处理到最终报告需5~7天，难以满足快速检测和应急响应的需求；（2）鉴定手段有限：传统生化鉴定对克罗诺杆菌与其近缘菌属（如肠杆菌属、柠檬酸杆菌属）的区分能力不足，容易产生误判；（3）与国际标准协调性不足：国际食品法典委员会（CAC）于2022年发布了修订后的克罗诺杆菌检验方法指南，国际标准化组织（ISO）也更新了ISO22964:2017标准，我国标准需要及时跟进以保持与国际规则的协调一致；（4）适用范围有待扩展：原标准主要侧重婴幼儿配方食品，对其他基质（如婴幼儿谷类辅助食品、即食食品等）的适用性说明不够明确。因此，对GB4789.40标准进行修订，引入更加灵敏、特异的检测技术，优化检测流程，实现与国际先进标准的有效衔接，成为亟待推进的技术任务。二、标准修订历程与工作概况2.1标准修订进程本标准修订工作于2020年正式启动，由国家卫生健康委员会委托国家食品安全风险评估中心组织，中国食品药品检定研究院作为主要起草单位牵头实施。修订过程经历了立项论证、方法学验证、实验室间比对、专家评审和公开征求意见等多个阶段：-2020年3月至6月：开展立项论证，系统梳理国内外克罗诺杆菌检验技术现状和标准需求；-2020年7月至2021年12月：完成方法学研究和实验室验证工作，包括灵敏度、特异性、检出限等关键指标的评估；-2022年1月至2023年6月：组织全国多家实验室开展协同验证实验，确保方法的稳定性和可重复性；-2023年7月至2024年1月：完成标准文本起草，向社会公开征求意见并逐条修改完善；-2024年2月8日：标准正式发布。2.2与上一版本的主要差异GB4789.40-2024相比原GB4789.40-2016，主要技术变化包括：（1）增加了实时荧光PCR方法，作为克罗诺杆菌检验的快速筛选手段，将检测周期缩短至24~48小时；（2）优化了前增菌和增菌步骤，对培养基配方和培养条件进行了调整，提高了目标菌的回收率；（3）完善了生化鉴定方案，引入更精准的鉴定系统，增强了对克罗诺杆菌属内不同种的区分能力；（4）明确了不同食品基质的适用要求，增加了对婴幼儿谷类辅助食品、乳粉及其他相关产品的适用性说明；（5）与ISO22964:2017标准进一步协调，对检验流程和结果表述进行了规范统一。三、标准的主要内容3.1适用范围本标准规定了食品中克罗诺杆菌（*Cronobacter*spp.）检验的基本方法，适用于婴幼儿配方食品、婴幼儿谷类辅助食品、乳及乳制品、特殊膳食食品及其他食品中克罗诺杆菌的检验。3.2方法原理本标准涵盖两种检验方法：传统培养法和实时荧光PCR快速筛选法。传统培养法的原理为：将样品接种于缓冲蛋白胨水（BPW）中进行前增菌，促进受损细胞的恢复；随后转接至改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（mLST）中进行选择性增菌；增菌液划线接种于克罗诺杆菌显色培养基平板进行分离培养；典型菌落经纯化后进行生化鉴定和（或）基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）鉴定，最终确认克罗诺杆菌的存在。实时荧光PCR法的原理为：以待检样品增菌培养物中提取的DNA为模板，针对克罗诺杆菌特异性靶基因（如*gluB*基因或核糖体RNA基因序列）设计引物和探针，通过实时荧光PCR仪进行扩增检测，根据扩增曲线和Ct值判定结果。PCR阳性结果需通过传统培养法进行确认。3.3主要技术要点3.3.1样品制备与前增菌称取检样100g（mL）加入900mL缓冲蛋白胨水中，均质后于36℃±1℃培养18h±2h。前增菌的目的在于修复受加工过程损伤的克罗诺杆菌细胞，提高检出率。3.3.2选择性增菌取前增菌培养液0.1mL接种于10mL改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（mLST）中，于44℃±0.5℃培养24h±2h。较高温度的选择性增菌可有效抑制背景菌群的生长，提高目标菌的富集效果。3.3.3分离培养用接种环取增菌培养物划线接种于克罗诺杆菌显色培养基（如R&F显色培养基或ChromogenicCronobacterIsolationAgar）平板，于44℃±1℃培养24h±2h。典型菌落在显色培养基上呈现蓝绿色或特征性颜色。3.3.4鉴定确证挑取典型菌落进行纯培养后，可采用以下方法进行鉴定确证：-生化鉴定：使用商品化生化鉴定系统（如API20E、VITEK2etc.）进行鉴定；-MALDI-TOFMS鉴定：利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行菌株鉴定，准确率高、速度快；-实时荧光PCR确认：对可疑菌落进行分子生物学确认。3.3.5结果报告传统培养法：经增菌、分离和鉴定确证，检出克罗诺杆菌判为阳性，报告"25g（mL）样品中检出克罗诺杆菌"。实时荧光PCR法：增菌培养物PCR检测阳性，且经传统培养法分离鉴定确认后，方可报告阳性结果。PCR初筛阴性但培养法阳性的情况，以培养法结果为准。四、国际标准比对与协调性分析4.1与ISO22964:2017的对比分析ISO22964:2017《食物链微生物学—克罗诺杆菌属的检测》是国际上最具权威性的克罗诺杆菌检验标准之一。GB4789.40-2024在修订过程中充分参考了ISO22964:2017的技术路线，同时在以下方面体现了适用性调整：（1）在增菌步骤中，GB4789.40-2024保留了mLST肉汤增菌法，同时参考ISO标准增加了相应的培养时间和温度要求；（2）在显色培养基选择方面，ISO22964:2017推荐使用ChromogenicCronobacterIsolationAgar（CCIA），我国标准在验证基础上明确了适用的国产和进口显色培养基；（3）我国标准增加了实时荧光PCR快速筛选方法，这是对ISO标准的超越和补充，在保证结果可靠性的前提下显著缩短了检测时间。4.2与国际食品法典委员会（CAC）标准的协调CAC在《婴幼儿配方奶粉的卫生操作规范》（CAC/RCP66-2008，2022年修订版）中对克罗诺杆菌的采样方案和微生物标准做出了明确规定：对于克罗诺杆菌，n=30，c=0，m=0/10g。GB4789.40-2024的检验方法和定量检测限能够充分满足CAC采样方案对检测方法的要求，检验结果可直接用于产品是否符合CAC微生物标准的判定。五、主要起草单位介绍5.1中国食品药品检定研究院概况中国食品药品检定研究院（NationalInstitutesforFoodandDrugControl，NIFDC）是中国食品药品检验检测领域的国家级权威技术机构，直属于国家药品监督管理局。其前身为成立于1950年的中央人民政府卫生部药物食品检验所，经过七十余年的发展，已成为集检验检测、标准研究、技术仲裁和质量控制于一体的综合性国家级研究机构。研究院拥有国家微生物保藏中心、国家药品标准物质制备中心等多个国家级技术平台，是食品安全国家标准制修订的核心技术支撑单位之一。5.2在标准研制中的技术贡献作为GB4789.40-2024的第一起草单位，中国食品药品检定研究院在标准修订过程中发挥了以下关键作用：（1）方法学基础研究：该院食品微生物检验团队长期从事食品中克罗诺杆菌的检测技术研究，建立了覆盖全国不同区域、不同食品基质的克罗诺杆菌菌株资源库，为标准的验证提供了丰富的菌株基础。研究团队对国内婴幼儿配方食品中克罗诺杆菌的污染状况进行了系统调查，积累了大量的基础数据。（2）分子检测技术的引入与验证：研究院率先在国内开展克罗诺杆菌实时荧光PCR检测方法的系统研究，筛选并优化了特异性引物和探针组合，建立了多重PCR和实时荧光PCR检测体系，并对方法的灵敏度（检出限≤10³CFU/mL增菌液）、特异性和抗干扰能力进行了全面评估，为该方法纳入国家标准提供了充分的实验依据。（3）实验室间协同验证的组织：在标准草案形成后，研究院组织全国12家省级及以上食品检验机构开展了协同验证实验，共测试了6类不同食品基质、8株标准菌株和20余株野生菌株，全面考核了标准方法的准确性、重复性和再现性，保证了标准在全国范围内的适用性和可靠性。（4）标准跟踪评价与国际交流：研究院代表中国参与ISO/TC34/SC9（食品微生物学）国际标准制修订工作，及时跟踪ISO22964标准的修订动态，将国际先进技术引入国内标准，同时也将中国在克罗诺杆菌检验方面的经验和技术成果反馈到国际标准体系中。六、标准的实施意义与预期效益6.1提升食品安全保障水平GB4789.40-2024的实施，为食品生产企业和食品安全监管机构提供了更加科学、高效的克罗诺杆菌检验技术手段。实时荧光PCR快速筛选方法的引入，使企业能够在24~48小时内完成原料和成品中克罗诺杆菌的筛查，显著提高了风险监测和预警的效率。6.2促进国际贸易便利化婴幼儿配方食品是国际贸易中的重要商品类别。新版标准在技术指标和检验方法上与国际标准高度协调一致，有助于消除因检验方法差异导致的贸易技术壁垒。我国婴幼儿配方食品的出口检验结果获得更多国际认可，也为进口食品的检验监管提供了更加严谨的技术依据。6.3推动检测技术进步新标准的实施对检验检测机构的能力建设提出了更高要求，推动了实时荧光PCR、MALDI-TOFMS等先进检测技术在基层检验机构中的普及应用。同时，标准的实施也为相关检测试剂盒、培养基和仪器设备的国产化发展提供了重要的市场空间和标准依据。对于婴幼儿配方食品生产企业来说，新标准不仅是合规检验的依据，也为企业内部质量管理体系的优化提供了技术支持。企业可依据标准中的快速检测方法建立更加高效的过程控制体系，从原料验收、生产过程监控到成品出厂检验各环节全面提升微生物安全控制水平。七、结论与展望GB4789.40-2024《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌检验》的发布实施，是我国食品安全标准体系建设的一项重要成果。该标准在充分吸收国际先进技术成果的基础上，结合我国食品微生物检验的实际需求，构建了以传统培养法为基础、分子生物学快速检测为补充的层级化检验技术体系，实现了检测灵敏度、特异性和时效性的全面提升。从发展趋势来看，克罗诺杆菌检验技术将朝着以下几个方向持续进步：下一代测序技术逐步应用于食源性致病菌的鉴定和溯源；数字PCR技术为低浓度目标菌的绝对定量提供新的可能；微流控芯片和生物传感器等即时检测技术的日趋成熟；基于大数据和人工智能的智能化鉴定系统的发展。这些新技术的成熟和推广，必将为下一轮标准的修订升级奠定技术储备。标准是质量的基石，也是安全的保障。GB4789.40-2024的贯彻实施，需要政府监管部门、检验检测机构、食品生产企业和科研院所的共同努力和密切协作。通过标准的有效实施和持续改进，必将为我国婴幼儿配方食品质量安全提供更加坚实的制度保障和技术支撑，为守护人民群众特别是婴幼儿群体的饮食安全筑起一道坚固防线。参考文献[1]国家卫生健康委员会.GB4789.40-2024食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌检验[S].北京:中国标准出版社,2024.[2]国家卫生健康委员会.GB4789.40-2016食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌（阪崎肠杆菌）检验[S].北京:中国标准出版社,2016.[3]InternationalOrganizationforStandardization.ISO22964:2017Microbiologyofthefoodchain—Horizontalmethodforthedetectionof*Cronobacter*spp.[S].Geneva:ISO,2017.[4]CodexAlimentariusCommission.CAC/RCP66-2008(Revised2022)CodeofHygienicPracticeforPowderedFormulaeforInfantsandYoungChildren[S].Rome:FAO/WHO,2022.[5]IversenC,MullaneN,McCardellB,etal.*Cronobacter*gen.nov.,anewgenustoaccommodatethebiogroupsof*Enterobactersakazakii*,andproposalof*Cronobactersakazakii*gen.nov.,comb.nov.,*Cronobactermalonat