GB 4789.49-2024 食品安全国家标准　食品微生物学检验　产志贺毒素大肠埃希氏菌检验标准立项发展报告

食品安全国家标准食品微生物学检验产志贺毒素大肠埃希氏菌检验标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:NationalFoodSafetyStandard—FoodMicrobiologicalExamination—ExaminationofShigaToxin-ProducingEscherichiacoli摘要产志贺毒素大肠埃希氏菌（ShigaToxin-Producing*Escherichiacoli*，STEC）是一类以产生志贺毒素为主要特征的重要食源性致病菌，其代表性血清型O157:H7及多种非O157血清型均可引发从轻度腹泻到溶血性尿毒综合征（HUS）甚至死亡等严重程度的疾病，对公众健康构成重大威胁。随着全球食品贸易的快速发展和检测技术的不断进步，建立科学、灵敏、准确的STEC检验方法标准，已成为食品安全监管体系建设的迫切需求。本标准（GB4789.49—2024）系依据《中华人民共和国食品安全法》及其实施条例，在充分参照ISO/TS13136:2012等国际先进标准的基础上，结合我国食品微生物检验实践和实验室能力现状而制定的食品安全国家标准。本标准规定了食品中产志贺毒素大肠埃希氏菌的检验程序和方法，涵盖增菌、分离培养、生化鉴定、血清分型以及基于PCR技术的志贺毒素基因（*stx1*、*stx2*）筛查和确证等关键技术环节，适用于食品及其原料中产志贺毒素大肠埃希氏菌的监测、溯源和风险评估。本标准的发布实施填补了我国在STEC系统性检验标准领域的空白，提升了食品微生物检验的技术能力和标准化水平，为食品安全风险监测、进出口食品检验和食品安全事故应急处置提供了重要的技术支撑。关键词：食品安全国家标准；产志贺毒素大肠埃希氏菌；食品微生物学检验；志贺毒素；聚合酶链式反应；标准制定Keywords:NationalFoodSafetyStandard;ShigaToxin-Producing*Escherichiacoli*;FoodMicrobiologicalExamination;ShigaToxin;PolymeraseChainReaction;Standardization1引言1.1标准立项背景产志贺毒素大肠埃希氏菌（STEC）是国际公认的重要食源性致病菌之一。根据世界卫生组织（WHO）的统计，STEC感染每年在全球范围内导致超过270万例急性疾病，其中约3,800例进展为溶血性尿毒综合征（HUS），是儿童急性肾功能衰竭的首要病因。STEC的天然宿主为反刍动物（尤其是牛），主要通过被粪便污染的食品（如未充分加热的牛肉、生鲜乳、受污染的水果蔬菜等）和水源传播。近年来，国内外STEC引发的食品安全事件屡有发生，1996年日本大阪暴发的O157:H7感染事件导致超过9,000人感染，2011年德国由O104:H4引发的STEC疫情更造成数千人感染和数十人死亡，引起了全球范围内的广泛关注。我国幅员辽阔，畜牧业和食品加工业分布广泛，STEC的流行和传播风险不容忽视。然而，在GB4789.49—2024发布实施之前，我国一直缺乏一套完整的、专门针对产志贺毒素大肠埃希氏菌检验的国家标准方法，制约了食品安全监管的有效性和食品微生物检验的规范化水平。1.2标准制定目的与意义本标准的制定旨在：（1）建立统一的STEC检验技术体系，确保不同实验室之间检测结果的可比性和可重复性；（2）提升我国对STEC相关食品安全事件的检测能力和应急响应速度；（3）与国际标准化组织（ISO）相关标准接轨，促进食品国际贸易中检测结果互认；（4）为食品安全国家标准中STEC限量规定的实施提供配套的方法学支撑，服务于《食品安全国家标准预包装食品中致病菌限量》（GB29921）等标准的执行。2标准编制原则与依据2.1编制原则本标准的编制遵循以下基本原则：（1）科学性原则：以微生物学、分子生物学和食品卫生学的科学理论为基础，充分吸收国内外最新研究成果，确保标准技术内容的科学性、先进性和可靠性。（2）与国际接轨原则：充分参考ISO/TS13136:2012《食品和动物饲料的微生物学——实时聚合酶链反应（PCR）法检测食源性致病菌——产志贺毒素大肠埃希氏菌的横向方法》等国际标准的技术框架，结合我国国情进行适当调整和优化。（3）适用性原则：综合考虑我国各级食品安全检测机构的技术能力和装备水平，确保标准方法具有广泛的适用性和可操作性。（4）协调一致性原则：与现行有效的食品安全国家标准体系相协调，与GB4789系列食品微生物学检验标准保持一致的技术风格和体例格式。2.2编制依据本标准依据以下法律法规和技术文件编制：（1）《中华人民共和国食品安全法》（2021年修正）第二十六条、第二十八条关于食品安全标准的规定；（2）《食品安全国家标准管理办法》（卫生部令第77号）；（3）GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》；（4）GB4789.1—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验总则》；（5）ISO/TS13136:2012《食品和动物饲料的微生物学——实时聚合酶链反应（PCR）法检测食源性致病菌——产志贺毒素大肠埃希氏菌的横向方法》；（6）FDABacteriologicalAnalyticalManual(BAM)中有关STEC检测方法的技术内容。3标准主要技术内容3.1适用范围本标准规定了食品中产志贺毒素大肠埃希氏菌（STEC）的检验方法，适用于食品及其原料中产志贺毒素大肠埃希氏菌的检验。标准涵盖了STEC检验的全流程技术环节，包括样品处理、增菌培养、分离纯化、初步鉴定、志贺毒素基因筛查和确证试验等。3.2方法原理本标准采用"选择性增菌—免疫磁珠富集（可选）—选择性平板分离—生化鉴定—血清学鉴定—分子生物学确证"的组合策略。其中，分子生物学确证采用聚合酶链式反应（PCR）方法，通过检测志贺毒素基因（*stx1*和*stx2*）来确证STEC。该技术路线兼顾了传统培养法的可靠性优势和分子生物学方法的高灵敏度特点。3.3主要技术要点（1）增菌：采用改良的胰蛋白胨大豆肉汤（mTSB）等增菌培养基，在适宜温度（41.5℃±1℃）下进行选择性增菌培养，以提高目标菌的检出率。（2）分离：使用产志贺毒素大肠埃希氏菌选择性显色培养基或MacConkey琼脂等培养基进行分离培养，观察典型菌落形态。（3）鉴定：通过生化试验（如靛基质试验、甲基红试验等）对可疑菌落进行初步鉴定，结合O抗原和H抗原血清学试验进行血清分型。（4）分子生物学确证：提取可疑菌落的DNA，采用PCR方法检测*stx1*和*stx2*基因。必要时可进一步检测*eae*（紧密素）基因和*ehxA*（溶血素A）基因等毒力相关因子。（5）结果报告：根据增菌、分离和确证试验结果，综合判定样品中是否检出产志贺毒素大肠埃希氏菌。3.4培养基与试剂标准对所需培养基和试剂的质量控制提出了明确要求，包括培养基的配制方法、灭菌条件、性能验证（使用标准菌株进行阳性对照和阴性对照测试）等，以确保各实验室检测结果的准确性和可比性。3.5质量保证与控制标准明确要求每批检验需设置阳性对照（如大肠埃希氏菌O157:H7标准菌株EDL933或ATCC43888等）和阴性对照，并规定了实验室内部质量控制的频次和判定标准。同时，对PCR实验室的布局和操作规范提出了防止交叉污染的指导性要求。4主要参与单位4.1标准主要起草单位4.2重点单位简介——中国疾病预防控制中心营养与健康所中国疾病预防控制中心营养与健康所（以下简称"营养与健康所"）是中国疾病预防控制中心直属的国家级专业技术机构，承担着全国营养与食品安全领域的科学研究、技术指导和政策咨询等重要职能。该所设有微生物学实验室，拥有一支高水平的专业技术团队和先进的实验设施，长期致力于食源性致病菌的检测技术研发、标准方法建立和食品安全风险评估工作。在STEC检验标准制定过程中，营养与健康所牵头组织了全国多家疾控机构开展了方法的验证和协同性研究，系统评估了不同增菌培养基和增菌条件对STEC分离率的影响，优化了PCR检测体系中引物和探针的设计方案，通过多轮实验室间比对试验验证了标准方法的灵敏度、特异性和重复性，为标准技术指标的确定提供了翔实的实验数据支持。多年来，营养与健康所在食品微生物学检验方法标准化领域取得了丰硕成果，主持或参与制修订了多项食品安全国家标准，在我国食品安全标准体系建设中发挥着不可替代的骨干作用。5标准实施与展望5.1标准实施意义GB4789.49—2024已于2024年8月8日正式实施。该标准的实施对于我国食品安全监管具有多方面的重要意义：（1）完善了食品微生物学检验标准体系。至此，我国已建立了覆盖沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157:H7、副溶血性弧菌、产志贺毒素大肠埃希氏菌等重点食源性致病菌的检验方法标准体系。（2）提升了STEC的检测能力和水平。本标准采用培养法与分子生物学方法相结合的技术路线，可有效提高STEC的检出率和检测准确性，为食品安全风险监测和食源性疾病暴发调查提供了有力的技术工具。（3）促进了与国际标准的对接和互认。本标准技术内容与国际主流标准保持一致，有助于消除食品国际贸易中的技术壁垒。5.2国内外STEC检验技术发展趋势从国际发展趋势来看，STEC检验技术正呈现出以下发展方向：（1）全基因组测序（WGS）技术的应用：WGS技术可提供菌株的完整基因组信息，不仅能够准确鉴定STEC的血清型和序列型（ST），还能精细解析毒力基因谱系和遗传进化关系，已在欧美国家的食源性疾病监测和暴发溯源中广泛应用。未来WGS有望作为传统检验方法的补充手段纳入标准体系。（2）数字化PCR（dPCR）和等温扩增技术：微滴式数字PCR（ddPCR）无需标准曲线即可实现目标核酸序列的绝对定量，具有更高的灵敏度和抗抑制能力。重组酶聚合酶扩增（RPA）、环介导等温扩增（LAMP）等新型等温扩增技术具有操作简便、设备要求低、适合现场快速检测等优势，在基层实验室和口岸快速筛查中具有广阔的应用前景。（3）免疫学快速检测技术的迭代升级：免疫磁珠分离（IMS）结合酶联免疫吸附试验（ELISA）或胶体金免疫层析技术的快速检测产品不断推陈出新，检测时间从传统培养法的数天缩短至数小时，在国际贸易食品的快速放行检测中得到广泛应用。（4）培养组学与新型选择性培养基的研发：针对非O157STEC血清型种类多、生化特性多样等特点，新型显色培养基不断涌现，结合特异性噬菌体或抗菌肽的筛选富集技术也在发展之中。5.3未来展望展望未来，本标准将在以下方面持续发挥重要作用：（1）服务于食品安全监管常态化：随着GB29921等标准中相关限量要求的执行，本标准将广泛应用于各级食品安全监管部门的日常监督抽检工作，为保障人民群众"舌尖上的安全"提供技术支撑。（2）支撑食源性疾病暴发调查：在STEC引起的食源性疾病暴发事件中，本标准规定的检验方法可为流行病学调查和溯源分析提供关键的实验室证据。（3）推动标准体系的持续更新迭代：随着分子生物学技术的快速发展和标准化研究的不断深入，适时启动标准的修订工作，将WGS、dPCR等新技术纳入标准体系，建立"传统培养+分子确证+基因组溯源"的多层级检验技术框架，将是我国食品微生物检验标准发展的必然方向。（4）助力食品安全国际共治：积极参与国际标准化组织（ISO/TC34/SC9）、国际食品法典委员会（CAC）等国际组织的标准化活动，推动我国STEC检验标准与国际标准的对接和互认，在全球食品安全治理中贡献中国方案和智慧。6结论GB4789.49—2024《食品安全国家标准食品微生物学检验产志贺毒素大肠埃希氏菌检验》是我国食品微生物学检验标准体系的重要组成部分。该标准的制定遵循了科学性、国际性、适用性和协调一致性的原则，在充分借鉴ISO/TS13136:2012等国际先进标准的基础上，结合我国食品安全监管实际和实验室检测能力，建立了涵盖选择性增菌、分离培养、生化鉴定、分子生物学确证等全流程的STEC检验技术体系。本标准的发布填补了我国在STEC检验方法标准化方面的空白，为食品安全国家标准的有效实施和食品安全监管工作的深入开展提供了有力的技术保障。参考文献[1]国家卫生健康委员会.GB4789.49—2024食品安全国家标准食品微生物学检验产志贺毒素大肠埃希氏菌检验[S].北京:中国标准出版社,2024.[2]国家卫生健康委员会.GB4789.1—2016食品安全国家标准食品微生物学检验总则[S].北京:中国标准出版社,2016.[3]国家卫生健康委员会.GB29921—2021食品安全国家标准预包装食品中致病菌限量[S].北京:中国标准出版社,2021.[4]InternationalOrganizationforStandardization.ISO/TS13136:2012Microbiologyoffoodandanimalfeed—Real-timepolymerasechainreaction(PCR)-basedmethodforthedetectionoffood-bornepathogens—HorizontalmethodforthedetectionofShigatoxin-producing*Escherichiacoli*(STEC)andthedeterminationofO157,O111,O26,O10