XXXXX微生物限度检查法适用性试验方案

XXXXX微生物限度检查法适用性试验方案1人员与职责1.1验证管理与参与人员本验证过程中涉及的所有人员如下：验证工作小组职责范围成员岗位质量负责人

组长

组员

组员

组员

组员

1.2职责说明人员职责分工质量负责人1.负责批准验证方案2.负责批准验证报告验证工作小组组长1.负责安排起草验证方案和验证报告2.负责安排与协调验证工作的实施3.对验证中出现的异常情况、偏差提出初步处理意见4.负责验证方案变更的申请5.负责分析评价验证数据6.负责验证方案和报告的审核QC1.负责起草、审核验证方案及报告2.方案起草人负责组织验证参与人员培训并考核3.负责验证的实施及验证过程中数据的收集和整理4.

验证中出现异常情况、偏差及时报告并参与调查QA1.负责验证工作的跟踪、监督2.审核验证方案及报告3.组织验证中出现的异常情况、偏差的调查处理4.对变更情况进行跟踪2验证项目验证项目包括：总需氧微生物数，霉菌、酵母菌总数，控制菌检查---大肠埃希菌。3方法描述3.1仪器移液枪（100~1000μL、1~10ml），生化培养箱（20~25℃，30~35℃），电子天平3.2培养基和试剂序号名称1胰酪大豆胨琼脂培养基2胰酪大豆胨液体培养基3沙氏葡萄糖琼脂培养基4麦康凯液体培养基5麦康凯琼脂培养基6pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液3.3供试液的制备称取供试品约10g，加入pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液约100ml，振摇混匀，静置，制备成1:10供试液。3.4总需氧微生物数计数—平皿法取1:10供试液1ml注入Φ90mm无菌平皿中，平行制备2个平皿，注入预先融化好并冷却至温度不超过45℃的15～20ml的胰酪大豆胨琼脂培养基，摇动平皿，使供试液与培养基混匀，于室温放置，待凝固后倒置于30～35℃生化培养箱培养5天。阴性对照：取1mlpH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液代替供试液，同法操作，制备一个平皿。计算：总需氧微生物数（cfu/g）=×10（稀释倍数）可接受标准：阴性对照应为阴性，总需氧微生物数≤103cfu/g。

3.5霉菌、酵母菌总数计数—平皿法取1:10供试液1ml注入Φ90mm无菌培养皿中，平行制备2个平皿，注入预先融化好并冷却至温度不超过45℃的15~20ml的沙氏葡萄糖琼脂培养基，摇动平皿，使供试液与培养基混匀，于室温放置，待凝固后倒置于20~25℃生化培养箱培养7天。阴性对照：取1mlpH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液代替供试液，同法操作，制备一个平皿。计算：霉菌、酵母菌总数（cfu/g）=×10（稀释倍数）可接受标准：阴性对照应为阴性，霉菌、酵母菌总数≤102cfu/g。3.6大肠埃希菌检查3.6.1供试品组：取1:10供试液10ml至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，置30～35℃生化培养箱培养18～24h；阴性对照组：取10mlpH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液代替供试液，与供试品组相同方法操作；阳性对照组：取1:10供试液10ml及1ml大肠埃希菌菌悬液（≤100cfu）与供试品组相同方法操作；3.6.2振摇胰酪大豆胨液体培养基培养物，取1ml至100ml麦康凯液体培养基中，摇匀，于42~44℃生化培养箱培养24~48h；3.6.3振摇麦康凯液体培养物，取适量划线接种于麦康凯琼脂培养基平板中，于30~35℃生化培养箱培养18~72h。3.6.5可接受标准：每1g应不得检出。4

微生物方法验证4.1菌种使用菌种代号总需氧微生物计数霉菌和酵母菌计数控制菌大肠埃希菌EC--√金黄色葡萄球菌SA√--铜绿假单胞菌PA√--枯草芽孢杆菌BS√--白色念珠菌CA√√-黑曲霉Ab√√-环境菌N/A√√-备注：菌液制备参考《菌种管理规程》4.2总需氧微生物数计数方法验证—平皿法4.2.1试验组取1:10供试液9.9ml和0.1ml菌悬液（SA、PA、BS、CA、Ab每种菌各做一次）混合作为试验组，使加入后菌液浓度≤100cfu/ml，混匀，分别取1ml注入Φ90mm无菌培养皿，每种菌悬液各平行制备2个平皿，注入预先融化好并冷却至温度不超过45℃的15～20ml的胰酪大豆胨琼脂培养基，摇匀使培养基与供试液充分混匀室温放置，待凝固后倒置于30～35℃生化培养箱培养≤3天（白色念珠菌、黑曲霉培养≤5天）。4.2.2菌液组取pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液9.9ml代替供试液，平行制备2个平皿，与试验组同法操作。4.2.3供试品组取1ml1:10供试液注入Φ90mm无菌平皿，平行制备2个平皿，注入预先融化好并冷却至温度不超过45℃的15～20ml的胰酪大豆胨琼脂培养基，摇匀后室温放置，待凝固后倒置于30～35℃生化培养箱培养5天。4.2.4阴性对照组取pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液1ml代替供试液，与供试品组同法操作，制备1个平皿。4.2.5计算公式：试验组的菌回收率（%）＝×100％4.2.6可接受标准阴性对照组应为阴性；试验组的菌回收率应为50％~200％。4.3霉菌、酵母菌总数计数方法验证—平皿法4.3.1试验组取1:10供试液9.9ml和0.1ml菌悬液（CA、Ab每种菌各做一次）混合作为试验组，使加入后菌液浓度≤100cfu/ml，混匀，分别取1ml注入Φ90mm无菌培养皿，每种菌悬液各平行制备2个平皿，注入预先融化好并冷却至温度不超过45℃的15～20ml沙氏葡萄糖琼脂培养基，摇动平皿，使供试液与培养基混匀，于室温放置，待凝固后倒置于20~25℃生化培养箱培养≤5天。4.3.2菌液组取pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液9.9ml代替供试液，与试验组同法操作。4.3.3供试品组取1ml1:10供试液注入Φ90mm无菌平皿，平行制备2个平皿，注入预先融化好并冷却至温度不超过45℃的15～20ml沙氏葡萄糖琼脂培养基，摇匀后室温放置，待凝固后倒置于20～25℃生化培养箱培养7天。4.3.4阴性对照组取pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液1ml代替供试液，与供试品组相同方法操作，制备1个平皿。4.3.5计算公式：试验组的菌回收率（%）＝×100％4.3.6可接受标准阴性对照组应为阴性；试验组的菌回收率应为50％~200％。4.4大肠埃希菌检查方法验证4.4.1试验组4.4.1.1取1:10供试液10ml至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，加入大肠埃希菌菌悬液1ml(≤100cfu)，摇匀，置于30～35℃生化培养箱培养18～24h；4.4.1.2震摇培养物，取1ml胰酪大豆胨液体培养基培养物至100ml麦康凯液体培养基中，摇匀，于42~44℃生化培养箱培养24~48h；4.4.1.3震摇培养物，取麦康凯液体培养基培养物适量划线接种于麦康凯琼脂培养基平板中，于30~35℃生化培养箱培养18~72h。4.4.2菌液稀释计数取大肠埃希菌菌悬液1ml(≤100cfu)注入Φ90mm无菌培养皿，平行制备2个平皿，注入预先融化好并冷却至温度不超过45℃的15~20ml的胰酪大豆胨琼脂培养基，摇动平皿，使菌悬液与培养基混匀，于室温放置，待凝固后倒置于30~35℃生化培养箱培养≤3天。4.4.3供试品组取1:10供试液10ml至100ml大豆酪蛋白消化肉