ISO 6888-12021Amd 12023 食物链微生物学凝固酶阳性葡萄球菌（金黄色葡萄球菌和其他种类）计数的水平方法第1部分使用Baird-Parker琼脂培养基的方法修改1标准立项发展报告

食物链微生物学凝固酶阳性葡萄球菌（金黄色葡萄球菌和其他种类）计数的水平方法第1部分：使用Baird-Parker琼脂培养基的方法修改1标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:Microbiologyofthefoodchain—Horizontalmethodfortheenumerationofcoagulase-positivestaphylococci(Staphylococcusaureusandotherspecies)—Part1:MethodusingBaird-Parkeragarmedium—Amendment1摘要食品安全是公共卫生领域的核心议题，而凝固酶阳性葡萄球菌（以金黄色葡萄球菌为代表）作为引发食源性疾病的常见致病菌，其准确、可靠的计数方法在国际贸易和食品安全监管中具有举足轻重的地位。ISO6888-1标准作为国际公认的食品中凝固酶阳性葡萄球菌计数的水平方法，在2021年完成全面修订后，其修订案ISO6888-1:2021/Amd1:2023于2023年9月12日由国际标准化组织正式发布。本报告系统阐述了该标准的立项背景、技术演进脉络与修订核心内容，分析了标准在培养基质量控制、结果判读准确性及实验室可操作性等方面的技术改进。研究表明，该修订案回应了食品微生物检验领域对方法精度和结果可靠性的更高要求，进一步提升了标准与国际食品微生物检验技术发展的适配性。本报告还介绍了主要参与单位的技术贡献，并对标准实施后对食品安全监管、国际贸易技术壁垒消除及实验室能力建设的深远影响进行了前瞻性分析。关键词：凝固酶阳性葡萄球菌；金黄色葡萄球菌；Baird-Parker琼脂；食品安全；水平方法；国际标准修订Keywords:coagulase-positivestaphylococci;Staphylococcusaureus;Baird-Parkeragar;foodsafety;horizontalmethod;internationalstandardamendment1引言食品安全问题始终是全球公共卫生领域关注的焦点。根据世界卫生组织（WHO）估算，全球每年约有6亿人因食用受污染的食品而患病，其中由微生物引起的食源性疾病构成最大威胁。在众多食源性致病菌中，凝固酶阳性葡萄球菌（Coagulase-positivestaphylococci,CPS）——以金黄色葡萄球菌（*Staphylococcusaureus*）为最主要代表——因其广泛的分布、较强的环境耐受性以及产生肠毒素的能力，长期被视为食品微生物检验的重点监控对象。凝固酶阳性葡萄球菌可通过污染肉制品、乳制品、即食食品等多种食品基质，在适宜条件下繁殖并产生金黄色葡萄球菌肠毒素（StaphylococcalEnterotoxins,SEs），消费者摄入后可在短时间内引发急性胃肠炎，表现为恶心、呕吐、腹泻等症状。因此，建立准确可靠的CPS计数方法，对于食品生产过程控制、终产品质量判定及国际贸易中的卫生互认具有基础性支撑作用。ISO6888-1标准作为食品微生物检验领域重要的水平方法标准，其全称为"食物链微生物学——凝固酶阳性葡萄球菌（金黄色葡萄球菌和其他种类）计数的水平方法——第1部分：使用Baird-Parker琼脂培养基的方法"。该标准在国际贸易食品检验、各国食品安全监管体系以及食品企业内部控制中均发挥着重要作用。2021年，ISO完成了对该标准的系统性修订（ISO6888-1:2021），全面提升了标准的适用性和技术先进性。在此基础上，2023年发布的修订案1（Amendment1）对部分关键内容进行了进一步的技术修正和补充，以回应实验室实践中的技术需求和标准使用者的反馈意见。本报告旨在系统梳理ISO6888-1:2021/Amd1:2023标准的立项背景、技术内容、修订要点和实际应用价值，为标准使用者提供全面的技术参考，并为我国食品微生物检验标准的制修订工作提供启发和借鉴。2标准立项背景与修订历程2.1金黄色葡萄球菌的食品安全风险金黄色葡萄球菌（*Staphylococcusaureus*）是一种革兰氏阳性、过氧化氢酶阳性的兼性厌氧球菌，广泛存在于自然界中，可在人类和动物的皮肤、鼻腔、咽喉等部位定植。据统计，约20%~30%的健康人群长期携带金黄色葡萄球菌。在食品加工环境中，CPS通过从业人员的手部接触、原料污染或设备交叉污染等途径进入食品链条。CPS的致病机制主要依赖于其产生的多种毒力因子，其中肠毒素是最关键的致病因子。金黄色葡萄球菌肠毒素耐热性强，即使在100°C条件下加热30分钟仍能保持部分活性，这意味着即使食品经过充分加热杀灭了细菌本身，已经产生的肠毒素仍可能导致疾病发生。食品中金黄色葡萄球菌数量达到105CFU/g以上时，其产生的肠毒素即可达到致病的阈值。因此，对CPS进行定量检测在保障食品安全中具有重要意义，而精确的计数方法是风险评估和有效监管的基础。2.2标准技术体系的演进ISO6888系列标准自1983年首次发布以来，经历了多次技术修订和内容更新，逐步形成了由以下三个部分组成的完整标准体系：-ISO6888-1：使用Baird-Parker琼脂培养基的方法，适用于一般食品和动物饲料中CPS的计数；-ISO6888-2：使用兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基的方法，作为替代性计数方案；-ISO6888-3：使用MPN（最大可能数）法进行低水平CPS的检测和计数。此次修订的Amd1:2023针对的是2021年全面修订版ISO6888-1:2021的技术补充。ISO6888-1:2021在结构上进行了重大调整，采用了ISO标准中通行的"水平方法"架构，将标准的适用范围扩展到整个食物链，涵盖人类消费和动物饲料的所有食品类别，同时引入了更加细化的培养基性能验证要求和结果判读规则。2.3修订案发布的工作基础Amd1:2023的立项和制定工作是在ISO/TC34/SC9（食品产品微生物学方法分技术委员会）框架下开展的。该分技术委员会是国际食品微生物检验标准制定的核心机构，秘书处由法国标准化协会（AFNOR）承担。参与修订案制定工作的专家来自各国国家标准机构、食品检验实验室、学术研究机构和产业界代表。Amd1:2023修订工作的技术基础主要来自以下几个方面：一是ISO6888-1:2021标准在全球范围内的广泛应用中积累的实践经验反馈；二是国际食品微生物标准化咨询委员会相关技术文件的最新进展；三是各国食品微生物检验实验室在标准实际操作中遇到的技术问题的集中反馈。3标准主要内容概述3.1方法原理ISO6888-1:2021/Amd1:2023所规定的CPS计数方法基于以下技术原理：将适当稀释度的样品悬液接种于选择性固体培养基Baird-Parker琼脂上，该培养基以亚碲酸钾和氯化锂作为选择性抑制剂，可有效抑制非目标菌群的生长。在37°C条件下培养24~48小时后，CPS在培养基上形成典型菌落特征——圆形、凸起、灰黑色至乌黑色、有光泽、直径1~3mm的菌落，周围具有透明的卵黄反应区（沉淀环）和乳白色混浊带。典型菌落经凝固酶试验确认后，以每克或每毫升样品中CPS的菌落形成单位（CFU）表示计数结果。3.2适用范围该标准规定的方法适用于：-人类消费用食品；-动物饲料；-食品生产环境样品。方法在实际应用中需注意基质的差异性，部分食品基质（如某些乳制品、发酵肉制品等）中可能存在背景菌群干扰或抑制剂残留问题，需要在样品制备阶段进行相应的技术处理。3.3培养基与试剂要求Baird-Parker琼脂培养基的基础成分包括酪蛋白胰酶消化物、牛肉浸膏、酵母浸膏、甘氨酸、丙酮酸钠和琼脂。基础培养基灭菌冷却至约47°C后，需无菌添加卵黄亚碲酸钾增菌剂。培养基的质量控制是整个检验流程中至关重要的一环，Amd1:2023对此提出了更加明确的要求，详见第4部分。3.4检验流程标准规定的检验流程包括以下关键步骤：样品制备与初始悬液配制、十倍梯度稀释、选择性培养基接种（表面涂布法，每个稀释度接种两个平皿）、37°C培养24~48小时、菌落计数与典型菌落特征判读、凝固酶确认试验（使用兔血浆）、结果计算与报告。4修订案核心内容与技术要点4.1培养基性能验证要求的强化Amd1:2023修订案对Baird-Parker琼脂培养基的性能验证要求进行了进一步明确和强化。标准明确规定，每批新配制的培养基或者新采购的商品化培养基，在使用前必须进行性能验证。验证试验应使用至少一个阳性对照菌株和一个阴性对照菌株。阳性对照菌株应选用典型的凝固酶阳性葡萄球菌（如*Staphylococcusaureus*ATCC6538或等同菌株），接种后应在Baird-Parker琼脂上良好生长，并呈现典型的菌落形态特征。阴性对照菌株可选择具有代表性的非目标菌（如*Escherichiacoli*ATCC25922或*Proteusmirabilis*等），接种后应被完全抑制或仅呈现微弱生长。修订案还对培养基的物理性能指标和批次间一致性提出了更明确的要求，要求实验室对每批培养基的pH值、凝胶强度、选择性指数和生长率进行记录和评估，确保不同批次培养基间的检测结果具有良好的可比性。4.2典型菌落判读标准的细化Baird-Parker琼脂上的CPS典型菌落特征因菌株差异和培养条件的不同可能表现出一定的形态多样性。Amd1:2023对典型菌落的判读标准进行了细化和补充，强调检验人员应关注以下关键形态学特征组合：-菌落直径（培养24小时后为1~1.5mm，48小时后增至2~3mm）；-菌落轮廓（圆形、凸起、边缘整齐）；-菌落颜色（灰黑色至乌黑色，有金属光泽）；-菌落周围透明环（卵磷脂酶作用形成的沉淀环）和乳白色混浊带（脂肪酶作用形成）。该修订案特别强调了对于菌落形态不够典型的可疑菌落，必须通过凝固酶试验进行确认。在实际检验中，某些凝固酶阳性葡萄球菌菌株可能在Baird-Parker琼脂上呈现非典型形态或延迟显色，因此仅凭菌落形态判断可能导致假阴性结果。标准提醒检验人员应充分认识这一局限性，并严格按照标准规定的确认程序操作。4.3凝固酶确认试验的优化凝固酶试验是CPS计数方法中不可或缺的确认步骤。Amd1:2023对凝固酶试验的具体操作细节进行了进一步的明确和补充，包括：使用兔血浆进行试管法凝固酶试验的具体操作要求；对接种量、孵育温度和时间等参数进行了精确规范；明确了结果判读标准，即血浆凝固形成凝块（部分或完全）即为阳性反应。此外，修订案还注意到某些凝固酶阳性葡萄球菌菌株在初次培养后可能出现凝固酶活性降低的风险，建议在可疑结果出现时进行纯培养后的二次确认试验，并增加阳性对照和阴性对照的设置要求，以确保确认结果的可靠性。其中，*Staphylococcusaureus*ATCC6538等标准菌株可作为阳性对照，*Staphylococcusepidermidis*等凝固酶阴性菌株可作为阴性对照。4.4实验室质量控制和结果报告要求Amd1:2023在实验室质量控制和结果报告方面提供了更为清晰的技术指引。在质量控制方面，修订案要求实验室在每次检验中同时进行阳性对照和阴性对照试验，以监控培养基质量、培养条件和操作流程的可靠性。检验结果的报告应包含以下关键要素：检测方法引用标准编号、检验样品标识信息、结果数值表达（CFU/g或CFU/mL）、计数不确定度和检测限说明。5主要参与单位（技术归口组织）介绍5.1ISO/TC34/SC9的组织架构与工作职能本修订案的技术归口组织为国际标准化组织下设的ISO/TC34（食品技术委员会）下属的SC9分技术委员会——食品产品微生物学方法分技术委员会（Microbiologyofthefoodchain）。SC9成立于1985年，秘书处由法国标准化协会（AFNOR）承担。该分技术委员会负责制修订食品链微生物检验领域所有国际标准，其工作范围涵盖食品、动物饲料和食品生产环境中微生物的检测、计数、鉴定和分型方法。SC9的组织架构由主席、秘书处和各成员国指派的专家代表团组成。目前SC9拥有正式成员（P成员）约30个，观察成员（O成员）约20个，我国是SC9的正式成员之一，由国家市场监督管理总局（国家标准化管理委员会）指派中国食品药品检定研究院等单位作为国内技术对口单位参与相关工作。5.2SC9的主要标准成果SC9在数十年的标准化工作中取得了丰硕成果，其制修订的标准覆盖了食品微生物检验的各个技术层面，包括但不限于：-ISO7218——食品和动物饲料微生物学检验的一般要求和指导准则；-ISO4833系列——微生物计数的水平方法（菌落计数技术）；-ISO6579系列——沙门氏菌检测和计数的水平方法；-ISO11290系列——单核细胞增生李斯特氏菌检测和计数的水平方法；-ISO16649系列——β-葡萄糖醛酸酶阳性大肠埃希氏菌计数的水平方法。上述标准在全球范围内被广泛采用，许多国家和地区将其转化为本国标准或作为食品微生物检验的参考方法。SC9的工作模式以专家工作组（WG）为核心，每个标准项目由指定的工作组召集人和项目负责人（ProjectLeader）牵头推进，各国专家共同参与技术讨论和草案修订。ISO6888-1修订案的工作组归口于SC9内设的WG2工作组（制修订检测方法的标准），该工作组长期追踪食品微生物检验技术的前沿进展，为核心标准的持续更新提供了坚实的技术支撑。5.3中国的参与情况与工作基础我国长期派出专家参与SC9的技术工作，在食品微生物检验标准领域不断贡献中国方案和中国经验。中国食品药品检定研究院作为国内技术归口单位，组织国内相关科研机构、检验机构和高等院校的专家参与ISO6888系列标准的制修订讨论，在标准的技术验证、实验室间协同试验等方面发挥了积极作用。这一参与机制为我国食品微生物检验标准与国际标准的技术对接，以及我国在国际标准化事务中话语权的提升创造了有利条件。6修订案的实施意义与影响分析6.1对食品安全监管的技术支撑Amd1:2023的发布和实施，为全球食品安全监管体系提供了更加严谨的CPS计数技术方案。更为明确的培养基性能要求、菌落判读标准和质量控制要求，有助于提高不同实验室间检验结果的一致性和可比性。对于食品安全监管部门而言，这意味着基于同一标准得出的检验数据和执法判定具有更强的技术可信度，有助于在国际贸易争端中构建更具说服力的技术证据链。6.2对国际贸易技术壁垒的消除食品国际贸易中，各国采用的CPS检测方法差异可能导致同一批次样品出现不同的检验结论，进而引发技术性贸易壁垒。ISO6888-1:2021/Amd1:2023作为国际公认的水平方法标准的修订案，为各国间的检测结果互认提供了更为完善的技术基础。标准修订内容的更新确保了检测方法与当前技术水平同步，进一步推动了国际贸易中食品安全检验结果的双边和多边互认进程。6.3对实验室能力建设的能力建设贡献该修订案的发布对各类食品微生物检验实验室提出了更加精细化的技术要求。实验室需根据修订内容，对内部的标准操作程序（SOP）、培养基质量控制方案和人员培训计划进行相应调整和升级。这一过程客观上推动了实验室技术能力的整体提升，促进了检测方法和质量控制理念的更新。尤其对于发展中国家和地区的实验室，ISO国际标准的技术指引对于其建立和完善食品微生物检验体系具有重要的参考价值。6.4对未来标准化工作的启示Amd1:2023的制定和实施体现了ISO食品微生物检验标准发展的几个重要趋势：一是标准内容不断向精细化和可操作性方向演进，回应实验室实践中的实际需求；二是质量管理理念（如培养基性能验证、阳性和阴性对照设置）在标准技术内容中占据越来越重要的地位；三是标准制定过程中更加注重与全球食品安全倡议、国际食品法典委员会（CodexAlimentarius）相关技术文件的协调一致；四是对新型检测技术的开放态度，Amd1中的某些技术要素调整为未来引入替代性快速检测方法预留了接口。7结论与展望ISO6888-1:2021/Amd1:2023作为食品微生物检验领域一项重要的国际标准修订案，其发布和施行进一步完善了凝固酶阳性葡萄球菌计数的标准化技术体系。该修订案在培养基性能验证、典型菌落判读、凝固酶确认试验和实验室质量控制等方面所做出的技术细化，不仅提高了检测方法的准确性、可靠性和实验室间的可比性，也为食品安全监管和国际贸易提供了更加坚实的技术支撑。当前，全球食品微生物检验技术正处于快速发展时期，分子生物学方法（如实时荧光定量PCR）、免疫学快速