CN119390816A 一种新型重组人源化胶原蛋白水凝胶制备方法 （山西锦波生物医药股份有限公司）

一种新型重组人源化胶原蛋白水凝胶制备提供了一种新型重组人源化胶原蛋白水凝交联剂的浓度为0.01_0.25并且重组人源化胶原蛋白为重组人源化II型、III型和XVII型胶2蛋白与二醛类交联剂进行反应，其中二醛类交联剂的浓度为0.01_0.25优选0.02％_优选地，所述重组人源化胶原蛋白在圆二色谱上的175_220nm优选地，重组人源化胶原蛋白的浓度为10_100mg/mL，10_70mg/mL优选地，重组人源化胶原蛋白具有SEQIDNO:4_7中任一项或与SEQ入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；优选地，重组人源化胶原蛋白是由大肠杆菌表达的或由胶原蛋白和二醛类交联剂进行反应达6_24小时、12_24小时、12_20小时或12_16小时的时2.制备交联重组人源化胶原蛋白凝胶的方法，其包括权利要求1的方法并且包括从交3将交联重组胶原蛋白粉末置于透析袋中，或者直接将交联重组胶原4.交联重组人源化胶原蛋白凝胶，其包含权利要求3的交联重组人源化胶原蛋白或通5.组合物，其包含权利要求3的交联重组人源6.制备胶原蛋白凝胶的方法，其包括用缓冲液和/7.使细胞粘附或贴壁或促进细胞迁移的方法，所述方法包括使细胞与根据权利要求3所述的交联重组人源化胶原蛋白、根据权利要求4的交联重组人源化胶原蛋白凝胶或权利8.化妆或美容方法，其包括对皮肤施用根据权利要求3所述的交联重组人源化胶原蛋9.根据权利要求3所述的交联重组人源化胶原蛋白410.根据权利要求3所述的交联重组人源化胶原蛋白、根据权利要求4的交联重组人源5[0002]胶原蛋白是广泛分布于人体结缔组织的一类蛋白质，也是人体含量最多的蛋白[0003]天然胶原分子可形成一种特殊的超螺旋结构，这种结构是以3个氨基酸残基为基述重组人源化胶原蛋白与二醛类交联剂进行反应，其中二醛类交联剂的浓度为0.01_6含SEQIDNO:1_3中任一项或与SEQIDNO:1_3中任一项具有至少50％、至少60％、至少[0024]在一个实施方案中，重组人源化胶原蛋白具有SEQIDNO:4_7中任一项或与SEQ少98％或至少99％同一性的氨基酸序列或SEQIDNO:4_7中任一项的氨基酸序列中取代、78[0051]在另一个方面，提供了本文所述的交联重组人源化胶原蛋白和/或组合物在制备[0068](1)本发明确定了适合于重组人源化胶原蛋白，特别是具有三螺旋结构的重组人源化胶原蛋白的醛类交联剂和最适反应条件。采用本发明的醛类交联剂和最适反应条件，可以在保留重组人源化胶原蛋白的三螺旋结构的情况下制备[0070](3)本发明发现本发明的方法适合于将具有三螺旋结构的重组胶原蛋白进行交联9[0081]如本文中所用，重组人源化胶原蛋白是由DNA重组技术制备的人胶原蛋白特定性复单元的串联重复构建得到。重复单元的数目可以存在一定变化。例如ChenHua等人BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications508(2019)1018e1023公开了可以GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP重复单元以及该重复单元的16个串联重复的T16均的螺旋构象或更有利的配体结合构型以促进细胞膜附着和粘附。R.Strawn等人，Biopolymers109(2018),e23226证明了具有多个以串联重复方式排列的相同三螺旋肽单元的重组胶原样蛋白可以自组装成微纤维用于生物药物和工业领域。J.Yao等人,J.Biochem.136(2004)643e649报道了含有I型胶原肽的串联重复的重组胶原蛋白样蛋白显括ALIGN(Myers和Miller,1988)、FASTA(Pearson和Lipman,1988；Pearson,1990)以及Gly为甘氨酸，X和Y表示相同或不同的氨基酸(其具体情况可在不同Gly_X_Y三联体的范围是将吸附酶化学交联到载体上。戊二醛法中戊二醛浓度和pH值等对于交联效果具有影响。源化胶原蛋白是III型重组人源化胶原蛋白、II型重组人源化胶原蛋白和XVII型重组人源中，II型重组人源化胶原蛋白具有一个或多个重复单元，重复单元包含SEQIDNO:2或与重复单元包含SEQIDNO:3或与SEQIDNO:3具有至少50％、至少60％、至少70％、至少含SEQIDNO:1_3中任一项或与SEQIDNO:1_3中任一项具有至少50％、至少60％、至少[0095]在一个实施方案中，重组人源化胶原蛋白具有SEQIDNO:4_7中任一项或与SEQ少98％或至少99％同一性的氨基酸序列或SEQIDNO:4_7中任一项的氨基酸序列中取代、[0098]本文的示例性重组人源化胶原蛋白均可根据现有技术的方法常规制备，例如CN201811254050.7；CN201811254050.7；CN201811438582.6和CN202311272338.8；业合成公司进行基因片段的合成将该构建成功的表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21[0103]4：取200μl该菌液均匀的涂布在含有氨苄青[0105]6.从转化好的LB平板中挑取单克隆菌落于10mlLB(含100μg/ml氨苄抗生素)培养5%β_巯基乙醇)，置于100℃沸水中煮10mi入pPiczalαA表达载体并且将pPiczalαA表达载体导入酵母感受态细胞(X33)中。对经转化蛋白的表达系统描述于例如US20120116的交联重组人源化胶原蛋白水凝胶。组合物还可以包含药学和/或化妆品可接受的载体或0.25％。二醛类交联剂的浓度是二醛类交联剂在反应体系中的终浓度，例如0.02％、方法常规制备，例如CN201811254050.7；CN201811254050.7；CN201811438582.6和[0121]方法还可以包括将重组人源化胶原蛋白溶解于缓冲溶液中，将pH调整为5.0_[0132]本文还提供了对有需要的受试者施用本文所述的交联重组人源化胶原蛋白或交[0134]本文还提供了交联重组人源化胶原蛋白或交联重组人源化胶原蛋白组合物在医化胶原蛋白产生的生物医学产品的非限制性实例和其可能应用包括但不限于：真皮植入[0138]提供以下实施例来阐述本发明。本领域技术人员应当理解实施例仅仅是例示性Sambrook等人(1989)，ColdSpringHarborlab.[冷泉港实验室]，冷泉港，纽约州；APracticalApproach,VolumesIandII[DNA克隆：实用方法，第I卷和第II卷]”， [0142]GEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGASGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGASGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGASGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERG列GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP，SEQIDNO:4)(制备方法和纯化方法见CN201811254050.7、GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP，蛋白序列GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP，SEQIDNO:5)NO:2)，序列GEPGLQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGPPGEPGLQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGPPGEPGLQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGPPGEPGLQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGPPGEPGLQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGPPGEPGLQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGPPGEPGLQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGPPGEPGLQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGPPGEPGLQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGP[0146]XVII型重组人源化胶原蛋白(基本重复单元GLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPA(SEQIDNO:3)，GLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPAGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPAGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPG胶原蛋白T16、II型重组人源化胶原蛋白或XVII型重组人源化胶原蛋白)充分溶解在1mL时，即得交联后的重组人源化胶原蛋白凝胶(交联前和交联后的形态如图3_图6和图8显[0152]将30mg重组人源化胶原蛋白(III型重组人源化胶原蛋白T16)充分溶解在1mL磷酸[0153]将交联后的重组人源化胶原蛋白冷冻干燥，经5[0160]1)用冰盒制冰机取冰，将4摄氏度过夜样品进行两倍梯度稀释(注意换枪头)，取[0170]设定扫描波长190_260nm空白缓冲液基线测试，采集样品溶液PBS在190_260nm范[0173]胶原蛋白的黏附活性检测方法可以参考文献JumingYao,SatoshiYanagisawa,TetsuoAsakura,Design,ExpressionandCharacterizationofCollagen_LikeProteinsBasedontheCellAdhesiveandCrosslinkingSequencesDerivedfrom型胶原