CN119391736A 一种重组菌株生产脱氧尿苷三磷酸的方法 （南京有为生物技术有限公司）

基因编辑方法对大肠杆菌基因组进行定向改造，定向改造包括以下内容：a.敲除核苷酸酶基因（yfbR/yfdR/ushA/umpH/umpG/yjjG阻断dUMP杆菌内源的尿苷激酶基因tdk，强化dU的磷酸化明提供一种重组菌株生产脱氧尿苷三磷酸的方2步骤1：利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑方法对大肠杆步骤2：以脱氧尿苷为起始底物，采用基因改造后的大肠杆菌发酵生产脱氧尿苷三磷1ATGGCACAGCTATATTTCTACTATTCCGCAAT61CAATCTTCATACAATTACCAGGAACGCGGCATGCGCACTGTCGTATAT121GATGATCGCTTTGGTGCCGGGAAAGTCAGTTCGC181TTATTTAACCAAAATTCATCATTATTTGATGAGA241ATTCATTGCGTACTGGTTGATGAATGCCAGTTTTTAACCAGACAAC301TCGGAGGTTGTCGATCAACTCGATATACCCGTACTTTGTTATGGT361CGAGGTGAATTATTTATTGGCAGCCAATACTTACTGGCATGGTCC421TTAAAAACCATCTGTTTTTGTGGCCGTAAAGCAAGCATGGTGCTGCGTCTTG481GGCAGACCTTATAACGAAGGTGAGCAGGTGGTAATTGGTGGTAATGAACGA541GTATGCCGTAAACACTATAAAGAGGCGTTACAAGTCGACTCATTA1ATGCGCAGTAAGTATATCGTCATTGAGGGGCTGG61AATGTGGTGGTTGAGACGCTCGAGCAACTGGGTATCCGCGACATGGTT121CCTGGCGGTACGCAACTTGCCGAAAAGTTAAGAA181GGCGATGAAGTCATTACCGATAAAGCCGAAGTTC241CTGGTAGAAACGGTCATCAAACCAGCTCTGGCTAACGGCACCTGG301CACGATCTCTCCACTCAGGCGTATCAGGGCGGCGGACGTGGTA361GCAACACTGCGTGATGCTGTTCTCGGGGATTTTCGCCCCGACTTA421GTTACCCCGGAAGTTGGCTTAAAACGCGCGCGTGCGCGCGGCGAGCTGG481CAAGAATCTTTCGATTTCTTTAATCGCACCCGCGCCCGCTATCTGGAACTGG541GATAAAAGCATTCATACCATTGATGCCACCCAGCCGCTGGAGGC601CGCACTACCGTGACCCACTGGGTGAAGGAGT4.根据权利要求2或3所述的一种重组菌株生产脱氧尿苷三磷酸的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9介导的基因编辑方法使用的质粒分别为pTarget和pCas9，其中pCas携带pTarget的消除系统、λ噬菌体的Red重组系统及Cas9蛋白表达系统，pTarget包含sgRNA序3步骤1中核苷酸酶基因（yfbR/yfdR/ushA/umpH/umpG/yjjG）、核苷三磷酸焦磷酸酶基因S2：按照质粒载体试剂盒说明进行构建，采用基因合成方法S3：基因合成后使用质粒载体试剂盒提供的引物扩增PCR产物_基因位点mbhA整合大肠杆菌内源的尿苷激酶基因tdN20序列；S2：按照质粒载体试剂盒说明进行构建，首先采用基因合成方法合成包含N20序列的S3：基因合成后使用试剂盒提供的引物扩增PCR产物_sgRNA_tdk片段，然后将sgRNA_tdk片段连接到pTarget质粒上，将pTarget_mbhA_tdk电转至上一改造阶段的感受态细胞辑质粒pTarget_mbhA_tdk和pCa基因位点yeeP整合大肠杆菌内源的dUMP激酶基因tmN20序列；S2：按照质粒载体试剂盒说明进行构建，首先采用基因合成方法合成包含N20序列的S3：基因合成后使用试剂盒提供的引物扩增PCR产物_sgRNA_tmk片段，然后将sgRNA_辑质粒pTarget_yeeP_tmk和pCa8.根据权利要求6或7所述的一种重组菌株生产脱氧尿苷三磷酸的方法，其特征在于，45或缺的试剂。聚合酶链反应（PCR）和其他用于DNA合成的PCR应用需要脱氧核苷三磷酸盐直接磷[0004]专利CN1269422A公开了一种脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法，以天然DNA为原料步骤1：利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑方法对大肠杆菌基因组进行定向改造，定向改造包括以下内容：a.敲除核苷酸酶基因（yfbR/yfdR/ushA/umpH/umpG/yjjG阻断61ATGGCACAGCTATATTTCTACTATTCCGCAAT61CAATCTTCATACAATTACCAGGAACGCGGCATGCGCACTGTCGTATAT121GATGATCGCTTTGGTGCCGGGAAAGTCAGTTCGC181TTATTTAACCAAAATTCATCATTATTTGATGAGA241ATTCATTGCGTACTGGTTGATGAATGCCAGTTTTTAACCAGACAAC301TCGGAGGTTGTCGATCAACTCGATATACCCGTACTTTGTTATGGT361CGAGGTGAATTATTTATTGGCAGCCAATACTTACTGGCATGGTCC421TTAAAAACCATCTGTTTTTGTGGCCGTAAAGCAAGCATGGTGCTGCGTCTTG481GGCAGACCTTATAACGAAGGTGAGCAGGTGGTAATTGGTGGTAATGAACGA541GTATGCCGTAAACACTATAAAGAGGCGTTACAAGTCGACTCATTAACGGCTA1ATGCGCAGTAAGTATATCGTCATTGAGGGGCTGG61AATGTGGTGGTTGAGACGCTCGAGCAACTGGGTATCCGCGACATGGTT121CCTGGCGGTACGCAACTTGCCGAAAAGTTAAGAA181GGCGATGAAGTCATTACCGATAAAGCCGAAGTTC241CTGGTAGAAACGGTCATCAAACCAGCTCTGGCTAACGGCACCTGG301CACGATCTCTCCACTCAGGCGTATCAGGGCGGCGGACGTGGTA361GCAACACTGCGTGATGCTGTTCTCGGGGATTTTCGCCCCGACTTA421GTTACCCCGGAAGTTGGCTTAAAACGCGCGCGTGCGCGCGGCGAGCTGG481CAAGAATCTTTCGATTTCTTTAATCGCACCCGCGCCCGCTATCTGGAACTGG541GATAAAAGCATTCATACCATTGATGCCACCCAGCCGCTGGAGGCCGTGATG601CGCACTACCGTGACCCACTGGGTGAAGGAGT[0010]进一步地，所述CRISPR/Cas9介导的基因编辑方法使用的质粒分别为pTarget和pCas9，其中pCas携带pTarget的消除系统、λ噬菌体的Red重组系统及Cas9蛋白表达系统，NGG_3’设计N20序列；S2：按照质粒载体试剂盒说明进行构建，采用基因合成方法合成包含N20序列的S3：基因合成后使用质粒载体试剂盒提供的引物扩增PCR产物_sgRNA片段，将sgRNA片段连接到pTarget质粒上得到基因编辑质粒pTarget_X，X为待敲除的基因，将7设计N20序列；S3：基因合成后使用试剂盒提供的引物扩增PCR产物_sgRNA_tdk片段，然后将因编辑质粒pTarget_mbhA_td设计N20序列；S3：基因合成后使用试剂盒提供的引物扩增PCR产物_sgRNA_tmk片段，然后将因编辑质粒pTarget_yeeP_tm本发明提供一种重组菌株生产脱氧尿苷三磷酸的方法，该方法利用CRISPR/Cas98利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑方法对大肠杆菌基因组进行定向改造，定向改路径；c.在假基因位点yeeP整合大肠杆菌内源的dUMP激酶基因tmk，强化dUMP的磷酸化路1ATGGCACAGCTATATTTCTACTATTCCGCAAT61CAATCTTCATACAATTACCAGGAACGCGGCATGCGCACTGTCGTATAT121GATGATCGCTTTGGTGCCGGGAAAGTCAGTTCGC181TTATTTAACCAAAATTCATCATTATTTGATGAGA241ATTCATTGCGTACTGGTTGATGAATGCCAGTTTTTAACCAGACAAC301TCGGAGGTTGTCGATCAACTCGATATACCCGTACTTTGTTATGGT361CGAGGTGAATTATTTATTGGCAGCCAATACTTACTGGCATGGTCC421TTAAAAACCATCTGTTTTTGTGGCCGTAAAGCAAGCATGGTGCTGCGTCTTG481GGCAGACCTTATAACGAAGGTGAGCAGGTGGTAATTGGTGGTAATGAACGA541GTATGCCGTAAACACTATAAAGAGGCGTTACAAGTCGACTCATTAACGGCTA1ATGCGCAGTAAGTATATCGTCATTGAGGGGCTGG61AATGTGGTGGTTGAGACGCTCGAGCAACTGGGTATCCGCGACATGGTT121CCTGGCGGTACGCAACTTGCCGAAAAGTTAAGAA181GGCGATGAAGTCATTACCGATAAAGCCGAAGTTC241CTGGTAGAAACGGTCATCAAACCAGCTCTGGCTAACGGCACCTGG301CACGATCTCTCCACTCAGGCGTATCAGGGCGGCGGACGTGGTA361GCAACACTGCGTGATGCTGTTCTCGGGGATTTTCGCCCCGACTTA421GTTACCCCGGAAGTTGGCTTAAAACGCGCGCGTGCGCGCGGCGAGCTGG481CAAGAATCTTTCGATTTCTTTAATCGCACCCGCGCCCGCTATCTGGAACTGG541GATAAAAGCATTCATACCATTGATGCCACCCAGCCGCTGGAGGCCGTGATG601CGCACTACCGTGACCCACTGGGTGAAGGAGT[0022]本发明采用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑方法进行工程菌株的构建，该方法所9的sgRNA表达框和重组片段，基因合成后使用试剂盒提供的引物扩增PCR产物_sgRNA片段，然后将sgRNA片段连接到pTarget质粒上，将pTarget_yfbR电转至大肠杆菌感受态细胞中，的sgRNA表达框和重组片段，基因合成后使用试剂盒提供的引物扩增PCR产物_sgRNA片段，的sgRNA表达框和重组片段，基因合成后使用试剂盒提供的引物扩增PCR产物_sgRNA片段，的sgRNA表达框和重组片段，基因合成后使用试剂盒提供的引物扩增PCR产物_sgRNA片段，的sgRNA表达框和重组片段，基因合成后使用试剂盒提供的引物扩增PCR产物_sgRNA片段，的sgRNA表达框和重组片段，基因合成后使用试剂盒提供