ISOTS 228592022 生物技术.生物银行.来自脐带组织的人类间充质基质细胞的要求标准立项发展报告

生物技术生物银行来自脐带组织的人类间质基质细胞的要求标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:Biotechnology—Biobanking—Requirementsforhumanmesenchymalstromalcellsderivedfromumbilicalcordtissue摘要随着再生医学和细胞治疗技术的迅猛发展，人类间质基质细胞（MesenchymalStromalCells,MSCs）因其多向分化潜能、免疫调节特性及旁分泌功能，已成为细胞治疗、组织工程和药物筛选等领域最具应用前景的细胞资源之一。脐带组织作为MSCs的重要来源，具有取材无创、伦理争议小、细胞增殖能力强、免疫原性低等独特优势，日益受到生物样本库和临床研究机构的广泛关注。然而，由于缺乏统一的国际标准，不同机构在脐带组织来源MSCs的采集、制备、质量控制、储存及运输等环节存在显著差异，严重影响了样本的可比性、研究结果的可靠性和临床转化的安全性。在此背景下，国际标准化组织（ISO）于2022年7月20日正式发布了ISO/TS22859:2022《生物技术生物银行来自脐带组织的人类间质基质细胞的要求》。本报告对该项标准的立项背景、编制过程、核心技术内容、应用价值及未来发展趋势进行系统阐述，旨在为国内生物样本库建设、细胞治疗研发及相关标准化工作提供参考和借鉴。关键词：生物技术；生物银行；间质基质细胞；脐带组织；标准化；细胞治疗；质量控制Keywords:Biotechnology;Biobanking;MesenchymalStromalCells;UmbilicalCordTissue;Standardization;CellTherapy;QualityControl1引言1.1研究背景间质基质细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，最初从骨髓中分离获得，随后在脂肪组织、脐带、脐带血、胎盘等多种组织中均被成功分离。相较于骨髓来源的MSCs，脐带组织来源的MSCs具有以下显著优势：第一，取材过程无创伤性，不涉及伦理争议，来源充足且易于获取；第二，细胞更原始，增殖能力和分化潜能更强；第三，免疫原性更低，免疫调节功能更为突出；第四，受供者年龄和健康状况的影响较小，质量更为均一。这些优势使得脐带组织来源的MSCs成为细胞治疗和再生医学研究中应用最为广泛的细胞资源之一。1.2标准化需求分析尽管脐带组织来源MSCs的应用前景广阔，但其标准化进程面临诸多挑战。首先，在采集环节，脐带的采集时机、采集方式、运输条件等缺乏统一规范，直接影响后续细胞分离的成功率和细胞质量。其次，在制备环节，组织消化方法、细胞分离纯化策略、培养体系（培养基组分、添加物、培养密度、传代次数等）在不同实验室之间存在显著差异，导致制备的MSCs在表型特征、功能特性和基因表达谱方面呈现高度异质性。再次，在质量控制环节，细胞活力、免疫表型标志物表达、多向分化能力、无菌检测、支原体检测、内毒素检测等质量指标的检测方法和判定标准在不同机构之间并不一致。最后，在储存和运输环节，冷冻保存液的配方、降温速率、储存温度监测、运输条件验证等同样缺乏统一的技术要求。这些标准化缺口导致了一系列问题：不同研究团队的研究结果难以进行有效比较和Meta分析；部分实验室制备的MSCs产品存在安全隐患；生物样本库间样本交换和共享面临障碍；监管机构对细胞产品的审评缺乏统一的技术依据。据文献报道，仅就MSCs的免疫表型鉴定而言，不同实验室采用的抗体克隆号、染色方案和分析策略差异巨大，导致同一批样本在不同实验室检测结果的一致性仅为60%—70%。因此，制定统一的国际标准已成为该领域健康发展的迫切需求。1.3国际标准化组织及技术委员会概况国际标准化组织（InternationalOrganizationforStandardization,ISO）成立于1947年，是全球最大的非政府性国际标准化机构，总部位于瑞士日内瓦。ISO/TC276“生物技术”技术委员会成立于2013年，下设多个工作组，其中WG2负责生物样本库领域的标准化工作。ISO/TC276/WG2汇集了来自世界各国的标准化专家，涵盖生物样本库建设、样本采集与处理、质量控制与质量管理等领域。目前，该工作组已发布多项关键标准，包括ISO20387:2018《生物技术生物样本库生物样本库通用要求》等。ISO/TS22859:2022正是在这一工作框架下，针对特定类型的生物样本——脐带组织来源的MSCs所制定的技术规范。2标准立项背景与编制过程2.1国际标准制定背景ISO/TS22859:2022的制定工作源于国际干细胞研究领域对标准化工作的迫切需求。2016年前后，国际干细胞研究学会（InternationalSocietyforStemCellResearch,ISSCR）等多个国际学术组织呼吁加强对干细胞研究和临床转化的标准化管理。与此同时，ISO/TC276在完成ISO20387《生物技术生物样本库生物样本库通用要求》的制定工作后，认识到虽然通用性要求已建立，但针对特定类型样本的技术规范仍然缺乏，尤其是对于活细胞样本，其采集、制备、质控和储存的技术要求远比常规生物样本复杂。在此背景下，2018年ISO/TC276/WG2正式启动脐带组织来源MSCs标准化工作项目。该项目由韩国科学技术研究院（KRIBB）牵头，联合中国、日本、德国、美国、英国等多个国家的标准化机构共同参与。经过广泛征集意见和多轮专家论证，项目组于2019年完成工作草案（WorkingDraft,WD），2020年形成委员会草案（CommitteeDraft,CD），2021年完成国际标准草案（DraftInternationalStandard,DIS）投票，最终于2022年7月20日正式发布为ISO/TS22859:2022。2.2标准制定工作原则该标准的制定遵循了以下核心原则：（1）科学性：标准内容基于最新的科学研究证据，充分考量了国际学术界在MSCs研究领域的重要成果和共识。例如，免疫表型鉴定指标参考了国际细胞治疗学会（ISCT）2006年提出的MSCs最低鉴定标准，同时结合后续研究进展进行了适当扩展和完善。（2）实用性：标准充分考虑不同规模和不同发展水平机构的实施能力，避免设置过高或不切实际的技术门槛，力求在技术先进性和实践可行性之间取得平衡。相关要求条款充分考虑了各类资源条件，兼顾了不同发展水平的参与方，确保标准具备广泛的适用性。（3）协调性：标准与已发布的ISO20387:2018、ISO21709:2020等标准保持协调一致，同时关注与各国药典、GMP规范等法规性文件的衔接，充分考虑了与各国监管要求的兼容性。（4）前瞻性：标准在满足当前技术需求的基础上，为未来技术发展留出了适当的扩展空间，以适应MSCs研究和应用领域的持续进步。3标准主要内容解读3.1标准适用范围与术语定义ISO/TS22859:2022规定了用于研究或治疗用途的脐带组织来源人类MSCs在采集、制备、质量控制、储存和分发等环节的技术要求。该标准适用于从事脐带组织MSCs采集和保藏的生物样本库，同时也适用于脐带组织MSCs制备和供应的相关机构。标准中明确界定的关键术语包括：-间质基质细胞（MesenchymalStromalCells,MSCs）：来源于中胚层的具有可塑黏附特性、成纤维细胞样形态和体外多向分化能力的成体干细胞群体；-脐带组织（UmbilicalCordTissue）：连接胎儿与胎盘的索状结构，由华通胶（Wharton'sJelly）、血管（两条动脉和一条静脉）及外覆羊膜上皮组成，是MSCs的重要来源组织；-代次（Passage）：细胞从接种至达到规定融合度后消化传代的过程；-群体倍增时间（PopulationDoublingTime）：细胞群体数量增加一倍所需的时间，是评价细胞增殖能力的重要参数；-集落形成单位（ColonyFormingUnit,CFU）：单个细胞接种后形成细胞集落的能力，反映细胞的克隆形成效率。3.2供者筛选与知情同意标准对脐带组织供者的筛选提出了明确要求。在供者纳入标准方面，建议供者年龄在18—35岁之间，无重大遗传性疾病家族史，无活动性感染性疾病，HBsAg、抗HCV、抗HIV-1/2、抗TP等血清学检测指标均为阴性。在排除标准方面，明确排除有恶性肿瘤病史、自身免疫性疾病、严重妊娠并发症等情况。标准特别强调了知情同意过程的规范性，要求供者在充分了解脐带组织MSCs采集目的、用途、潜在风险和获益后签署书面知情同意书，同时要求生物样本库建立供者身份信息保护机制，确保供者隐私安全。3.3脐带组织采集、运输与接收标准对脐带组织的采集环节作了详细规定。采集时机方面，要求脐带组织应在胎儿娩出后尽快采集，常温下离体至开始处理的时间应不超过24小时，2—8℃条件下可适当延长至48小时。采集操作方面，要求使用无菌容器，采集长度不少于10cm，同时记录供者编号、采集时间、采集地点、脐带外观评价等关键信息。运输条件方面，标准要求使用validated的运输容器，维持规定的温度范围，并配备温度监测记录装置。样本接收环节，要求对脐带组织进行外观检查（包括长度、完整性、颜色、有无凝血等），核对送检单据与样本标签信息的一致性，并记录接收时间和接收人。任何不符合接收标准的情况均应在记录中明确标注。3.4MSCs分离与制备标准允许使用组织块贴壁法和酶消化法两种MSCs分离方法，但对每种方法的关键参数提出了明确要求。组织块贴壁法要求将华通胶组织剪切成1—2mm³的小块，均匀铺于培养皿底部，在37℃、5%CO₂条件下培养。酶消化法则推荐使用II型胶原酶或透明质酸酶，并对酶浓度（一般为0.1%—0.2%）、消化时间（一般为30—60分钟）和消化温度（一般控制在37℃）提出了建议范围。标准同时强调，各机构应对所采用的分离方法进行充分的验证，确保方法的可重复性和细胞质量的一致性。在培养体系方面，标准推荐使用添加了血小板裂解物（PlateletLysate）或胎牛血清（FetalBovineSerum,FBS）的培养基。使用FBS时，其浓度一般为10%；使用血小板裂解物时，其浓度一般为5%—10%。标准建议培养条件为37℃、5%CO₂、饱和湿度。细胞传代方面，标准建议细胞融合度达到70%—80%时进行传代，推荐使用胰蛋白酶/EDTA进行消化，消化时间一般控制在3—5分钟。3.5质量控制要求质量控制是ISO/TS22859:2022的核心内容。标准从细胞特性鉴定、微生物安全性检测和功能活性评价三个维度建立了全面的质量控制体系。（1）细胞特性鉴定方面，标准规定脐带组织来源MSCs应满足以下免疫表型特征：阳性标志物CD73、CD90、CD105的表达率应不低于95%；阴性标志物CD34、CD45、CD11b或CD14、CD79α或CD19及HLA-DR的表达率应不高于2%。多向分化能力方面，标准要求通过体外诱导分化实验验证细胞的成骨分化、成软骨分化和成脂分化能力，并建立明确的鉴定标准。成骨分化通过茜素红S染色检测钙结节形成，成软骨分化通过阿尔辛蓝染色检测蛋白聚糖沉积，成脂分化通过油红O染色检测脂滴形成。此外，标准还建议对细胞增殖能力进行评估，包括群体倍增时间和克隆形成效率等指标。（2）微生物安全性检测方面，标准要求对细胞产品进行全面的微生物检测，包括无菌检查（需氧菌和厌氧菌）、支原体检测、内毒素检测。无菌检查应依据各国药典规定的方法执行，支原体检测推荐采用培养法和PCR法联合检测，内毒素含量应不高于5EU/mL。（3）功能活性评价方面，标准引入了免疫调节功能评价指标，建议通过混合淋巴细胞反应（MixedLymphocyteReaction,MLR）或细胞因子分泌谱分析等方法评价MSCs的免疫抑制能力。同时建议对细胞的旁分泌功能进行评价，包括血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）、转化生长因子-β（TGF-β）等关键细胞因子的分泌水平检测。标准推荐应建立每一批细胞的质量检验报告，并将质量数据纳入产品放行审核程序。3.6冷冻保存、储存与运输标准对MSCs的冷冻保存和长期储存提出了明确要求。冷冻保存方面，推荐使用含有10%二甲基亚砜（DMSO）的冷冻保存液，采用程序降温法进行降温，降温速率为-1℃/min，最终储存于液氮气相或液相中。标准要求对冷冻保存后的细胞进行复苏验证，复苏后细胞活力应不低于70%，复苏后细胞应保持良好的增殖能力和多向分化能力。储存监控方面，要求建立连续温度监测系统和报警系统，定期检查液氮储量，并做好完整的记录。运输环节，要求使用通过验证的运输容器维持-150℃以下的温度条件，配备温度记录仪，建立运输过程应急预案确保样本安全。标准同时规定，对于冷冻保存后的细胞代次，建议最终产品代次不超过第5代。3.7文件记录与可追溯性标准强调全过程文件记录与可追溯性管理。要求生物样本库建立涵盖供者信息、脐带组织采集记录、细胞制备批记录、质量控制检验报告、储存位置记录、分发与运输记录等全流程的完整文档体系。每种细胞产品应赋予唯一的标识编码，确保从供者到最终用户的完整可追溯链条。记录保存期限方面，要求保存期限不少于细胞产品使用后30年。在信息化管理方面，建议采用符合21CFRPart11要求的电子记录系统，确保数据的完整性、安全性和可追溯性。4主要起草单位介绍4.1韩国生命工学研究院（KRIBB）韩国生命工学研究院（KoreaResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology，KRIBB）作为ISO/TS22859:2022的牵头起草单位，在标准制定中发挥了核心作用。KRIBB成立于1985年，是韩国科学技术信息通信部直属的国家级生命科学研究机构，在生物资源保藏、干细胞生物学、生物工艺开发等领域具有雄厚的科研实力和国际影响力。KRIBB下属的韩国国家生物资源中心（KoreaNationalResearchResourceCenter）运营着亚洲规模最大的生物样本库之一，积累了丰富的细胞资源标准化保藏经验。在MSCs研究领域，KRIBB研究团队在脐带组织MSCs的分离培养、规模化扩增、质量控制及临床转化等方面取得了系列重要成果，发表SCI论文200余篇，获得国际专利30余项。KRIBB还积极参与ISO/TC276的各项标准化工作，其专家团队在生物样本库标准化的国际治理中发挥着引领作用。在ISO/TS22859:2022的制定过程中，KRIBB牵头组织了韩国国内脐带组织MSCs研究机构、医疗机构和生物制药企业的研讨和协调工作，主导了标准提案的起草和关键技术指标的论证。4.2中国参与单位及贡献中国作为ISO/TC276的重要成员国，深度参与了ISO/TS22859:2022的制定工作。中国合格评定国家认可委员会（CNAS）、中国标准化研究院、中国人民解放军总医院、北京协和医院等单位的专家参与了该标准各阶段草案的技术评审和投票工作。中国依托前期建立的脐带组织MSCs采集、制备和质量控制的规范化体系，为该标准的制定提供了大量实践经验和技术数据支持。中国的参与不仅体现了我国在干细胞研究和生物样本库领域的国际影响力，也为我国相关标准化工作与国际接轨奠定了基础。5标准应用价值与影响分析5.1对生物样本库行业的规范引领ISO/TS22859:2022的发布填补了国际标准在特定类型活细胞样本保藏领域的技术空白，标志着生物样本库标准化工作从通用要求向专业领域纵深发展。该标准的实施将有效促进全球各生物样本库在脐带组织来源MSCs的采集、制备、