ISO 6888-12021 食物链微生物学.凝固酶阳性葡萄球菌（金黄色葡萄球菌和其他种类）计数的水平方法.第1部分使用Baird-Parker琼脂培养基的方法标准立项发展报告

食物链微生物学凝固酶阳性葡萄球菌（金黄色葡萄球菌和其他种类）计数的水平方法第1部分：使用Baird-Parker琼脂培养基的方法标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:Microbiologyofthefoodchain—Horizontalmethodfortheenumerationofcoagulase-positivestaphylococci(Staphylococcusaureusandotherspecies)—Part1:MethodusingBaird-Parkeragarmedium摘要凝固酶阳性葡萄球菌（Coagulase-positivestaphylococci,CPS）是食物链微生物学中最重要的食源性致病菌指标之一，其中以金黄色葡萄球菌（*Staphylococcusaureus*）为主要代表，可引起多种食物中毒事件并对公众健康构成严重威胁。随着全球食品贸易一体化进程的加快和食品安全监管要求的持续提升，建立统一、可靠的微生物计数方法成为国际标准化组织（ISO）及各成员国食品微生物学领域的关键任务。ISO6888-1:2021《食物链微生物学凝固酶阳性葡萄球菌（金黄色葡萄球菌和其他种类）计数的水平方法第1部分：使用Baird-Parker琼脂培养基的方法》作为该领域的基础性水平方法标准，规范了基于选择性培养基的CPS菌落计数流程，为食品生产企业、检测机构和监管部门的微生物检测提供了技术依据。本报告从标准编制的背景与意义出发，系统阐述了ISO6888-1:2021的修订历程、主要技术内容、关键试验步骤和质量控制要求，深入分析了该标准在国内外食品安全标准体系中的核心地位与广泛应用前景，同时对主要编制单位的技术贡献进行了介绍，并对标准的未来发展方向作出了展望。本报告的编制旨在为相关领域技术人员和标准管理人员提供全面、系统的标准立项参考信息，助力标准在我国食品微生物检测工作中的深入实施与本土化应用。关键词：凝固酶阳性葡萄球菌；金黄色葡萄球菌；Baird-Parker琼脂培养基；水平方法；食品微生物学；国际标准；菌落计数AbstractCoagulase-positivestaphylococci(CPS),predominantlyrepresentedby*Staphylococcusaureus*,constituteoneofthemostsignificantfoodbornepathogenicindicatorsinfoodchainmicrobiology,posingseriousthreatstopublichealththroughfoodpoisoningevents.Withtheaccelerationofglobalfoodtradeintegrationandthecontinuousenhancementoffoodsafetyregulatoryrequirements,establishingunifiedandreliablemicrobiologicalenumerationmethodshasbecomeacriticaltaskfortheInternationalOrganizationforStandardization(ISO)anditsmemberbodiesinthefieldoffoodmicrobiology.ISO6888-1:2021,*Microbiologyofthefoodchain—Horizontalmethodfortheenumerationofcoagulase-positivestaphylococci(Staphylococcusaureusandotherspecies)—Part1:MethodusingBaird-Parkeragarmedium*,servesasafundamentalhorizontalmethodstandardinthisfield,specifyingthestandardizedproceduresforCPScolonyenumerationbasedonselectiveculturemedia,therebyprovidingtechnicalbasisformicrobiologicaltestingbyfoodmanufacturers,testinglaboratories,andregulatoryauthorities.Thisreportsystematicallyelaboratestherevisionhistory,maintechnicalcontents,keyexperimentalprocedures,andqualitycontrolrequirementsofISO6888-1:2021,analyzesitscorepositionandbroadapplicationprospectswithindomesticandinternationalfoodsafetystandardsystems,introducesthetechnicalcontributionsofmajordraftingorganizations,andpresentsprospectsforfuturestandarddevelopment.Thecompilationofthisreportaimstoprovidecomprehensiveandsystematicreferenceinformationfortechnicalpersonnelandstandardmanagementprofessionals,facilitatingthein-depthimplementationandlocalizedapplicationofthestandardinChina'sfoodmicrobiologicaltestingpractices.Keywords:Coagulase-positivestaphylococci;Staphylococcusaureus;Baird-Parkeragarmedium;Horizontalmethod;Foodmicrobiology;Internationalstandard;Colonyenumeration一、引言1.1研究背景食品安全是全球公共卫生领域永恒关注的核心议题。根据世界卫生组织（WHO）的估计，全球每年约有6亿人因食用受污染的食品而患病，其中约42万人死亡，而微生物污染是导致食源性疾病的首要因素之一。在众多食源性病原微生物中，凝固酶阳性葡萄球菌（CPS）因其广泛的分布性、较强的环境耐受性和明确的致病机制而备受关注。金黄色葡萄球菌作为CPS类群中最具代表性的菌种，能够产生多种肠毒素（Staphylococcalenterotoxins,SEs），即使在加热处理后毒素仍保持活性，是引起细菌性食物中毒的常见病原体之一。从国际食品微生物标准委员会（ICMSF）的统计资料来看，CPS引发的食物中毒事件在全球范围内居高不下，涉及乳制品、肉制品、即食食品、烘焙食品等多种食品类别。我国食品安全事件监测数据亦显示，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件在细菌性食物中毒中占有相当比例。因此，建立准确、可靠、可比的CPS计数方法，对于食品生产过程控制、终产品检验和食品安全风险评估均具有不可替代的作用。1.2标准立项的必要性在全球食品贸易日益频繁的背景下，不同国家和地区采用的微生物检测方法存在差异，导致检测结果难以互认，增加了国际贸易中的技术壁垒。国际标准化组织（ISO）制定的食品微生物学水平方法标准，正是为了消除这些差异，实现检测方法的全球统一。ISO6888-1作为CPS计数的经典水平方法标准，自1983年首次发布以来，经历了多次修订和技术更新，其现行版本ISO6888-1:2021凝聚了国际食品微生物学领域的最新研究成果和技术共识，是当前全球范围内应用最为广泛的CPS计数基准方法。因此，对该标准进行全面、深入的立项发展报告研究具有重要的理论价值和实践指导意义。二、标准概述2.1标准基本信息ISO6888-1:2021由国际标准化组织下设的ISO/TC34（食品产品技术委员会）所属SC9分技术委员会（食品微生物学）负责制定和维护。该标准作为ISO6888系列标准的第1部分，与ISO6888-2（使用兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基的方法）和ISO6888-3（检测低数量级的方法）共同构成了完整的CPS计数标准体系。本标准现行版本为第三版，替代了ISO6888-1:1999及其修订版ISO6888-1:1999/Amd1:2003。与前一版本相比，ISO6888-1:2021在标准的整体框架上进行了调整，使其与ISO7218（食品和动物饲料微生物学的一般要求）以及ISO11133（培养基的制备和生产）等通用标准保持一致，体现了ISO食品微生物学标准系列的协调性和一致性原则。2.2适用范围与领域本标准适用于人类消费和动物饲料用产品的CPS计数，涵盖以下产品类别：-适用于所有食品及动物饲料的微生物检验，包括但不限于乳及乳制品、肉及肉制品、水产品、蛋制品、即食食品等；-适用于生产环境样品的检验（不适用于对农产品初级生产样品的检测）；-适用于对凝固酶阳性葡萄球菌进行计数或存在性检测的场景。该标准作为“水平方法”（horizontalmethod）标准，其设计理念是提供适用于各类食品基质的通用检测方案，而非针对特定产品类别的专用方法。这一特点使得该标准在不同食品类别的微生物检测中具有广泛的适用性和良好的协同性，有效避免了不同产品标准之间方法冲突的问题。2.3方法原理ISO6888-1:2021规定的方法基于以下技术原理：将适宜稀释度的测试样品接种于Baird-Parker琼脂培养基上进行选择性培养。Baird-Parker培养基含有氯化锂（抑制革兰氏阴性菌生长）和亚碲酸钾（抑制非葡萄球菌的革兰氏阳性菌生长），同时含有卵黄亚碲酸盐乳液作为鉴别系统。凝固酶阳性葡萄球菌在该培养基上典型形成灰色至黑色菌落，周围具有透明晕圈（卵磷脂酶活性所致）和不透明沉淀环（脂肪酶活性所致）。在35~37℃条件下培养24~48小时后，对典型菌落进行计数，并通过凝固酶试验对可疑菌落进行确认。最终结果以每克或每毫升样品中凝固酶阳性葡萄球菌的菌落形成单位数（CFU）表示。三、标准主要技术内容3.1试验原理与培养基本标准的试验原理基于Baird-Parker琼脂的选择性和鉴别性双重功能。Baird-Parker琼脂培养基的配方经过精心设计，其主要成分及功能如下：|成分|含量（g/L）|功能||------|-------------|------||胰蛋白胨|10.0|提供氮源和生长因子||牛肉浸膏|5.0|提供碳源和维生素||酵母浸膏|1.0|提供B族维生素||甘氨酸|12.0|促进葡萄球菌生长||丙酮酸钠|10.0|促进葡萄球菌生长||氯化锂|5.0|抑制革兰氏阴性菌||琼脂|15.0|凝固剂||亚碲酸钾|0.1|抑制干扰菌群||卵黄乳液|50mL/L|鉴别系统|该培养基在灭菌后冷却至45~50℃时，需加入无菌的卵黄亚碲酸盐乳液补充剂，混匀后倾注平板。制备好的平板应呈琥珀色、不透明状，在2~8℃条件下避光保存，有效期为24~48小时。3.2主要试验步骤3.2.1样品制备与初始悬浮液按照ISO6887系列标准的规定制备样品初始悬浮液和十进稀释液。对于不同类型的样品，需选择合适的稀释液和均质方式。一般使用缓冲蛋白胨水（BPW）或0.1%蛋白胨盐水作为稀释液，均质时间通常为1~2分钟。3.2.2接种与培养使用无菌移液管将0.1mL的测试悬浮液（或适宜稀释度的稀释液）接种于干燥的Baird-Parker琼脂平板表面，立即使用无菌玻璃涂布棒将接种物均匀涂布于整个平板表面。每个稀释度接种两个平板以确保统计可靠性。接种完成后，将平板在35~37℃条件下需氧培养24~48小时。标准规定在培养24小时后进行首次观察，若无典型菌落生长或菌落过小，则继续培养至48小时。值得注意的是，传统方法中推荐采用0.1mL接种量涂布接种，这一设计基于Baird-Parker琼脂培养基较强的选择性和菌落形态鉴别的需要，0.1mL接种量便于菌落均匀分布和形态观察。如在检测低数量级CPS时，可根据ISO6888-3的规定采用更大接种量进行检测。3.2.3菌落计数与确认培养结束后，选择菌落数在15~300CFU/平板范围内的平板进行计数。对呈现典型形态的菌落（灰色至黑色，圆形，光滑，直径1~5mm，周围有透明晕圈和不透明沉淀环）进行计数。对可疑菌落，需进一步进行以下确认试验：-凝固酶试验：使用兔血浆进行凝固酶试管试验。挑取可疑菌落接种于脑心浸液肉汤（BHI）中，35~37℃培养18~24小时后，取0.1mL培养物加入0.3mL兔血浆中，35~37℃水浴培养4~6小时，观察是否出现凝块。出现任何程度的凝块即判定为凝固酶阳性。-辅助鉴别试验（可选）：包括革兰氏染色（呈阳性球菌）、过氧化氢酶试验（呈阳性）、厌氧葡萄糖发酵试验等，用于辅助确认菌落鉴定结果的准确性。3.2.4结果计算与报告根据确认后的典型菌落数和稀释倍数，按照以下公式计算样品中CPS的含量：\[N=\frac{\sumC}{V\times(n_1+0.1n_2)\timesd}\]其中：N为样品中CPS的菌落形成单位数（CFU/g或CFU/mL）；∑C为所有计数平板上典型菌落总数；V为每个平板的接种量（mL）；n₁为第一个稀释度计数的平板数；n₂为第二个稀释度计数的平板数；d为第一个计数稀释度的稀释因子。结果应按照ISO7218的规定进行四舍五入，以科学计数法或两位有效数字报告，单位为CFU/g或CFU/mL。3.3质量控制要求3.3.1培养基质量控制按照ISO11133的要求，每批制备的Baird-Parker琼脂培养基均应进行质量验证试验。标准规定使用的阳性对照菌株为*Staphylococcusaureus*（如ATCC®6538（以食品微生物学检测中常用的ATCC6538菌株为例）或同等菌株），阴性对照菌株为*Escherichiacoli*（如ATCC®25922或同等菌株）和*Proteusmirabilis*（如ATCC®29906或同等菌株）。阳性对照菌株应在培养基上呈现典型菌落形态（黑色菌落、周围有透明晕圈），阴性对照菌株应被抑制或呈现非典型形态（如大肠杆菌被完全抑制，奇异变形杆菌部分被抑制且无典型特征）。3.3.2实验室内部质量控制标准要求实验室定期参加能力验证（ProficiencyTesting,PT）活动，并建立内部质控程序，包括使用标准菌株进行人员比对、仪器设备校准、培养箱温度验证等。每次试验应设置试剂空白对照以监控检验过程的无菌状态。3.4方法性能指标ISO6888-1:2021所规定的方法在实验室间验证研究中表现出良好的性能特征。根据国际validation研究数据，Baird-Parker琼脂培养基对CPS的检出限通常为10CFU/g（mL）（以1:10稀释液接种0.1mL计算），在10²~10⁶CFU/g（mL）范围内具有较好的线性关系。方法的选择性较强，对革兰氏阴性菌和非葡萄球菌的革兰氏阳性菌具有良好的抑制作用。需注意的是，具体的方法性能指标可能受到食品基质的影响，因此在检测特定类型样品时，实验室应结合基质特性进行方法适用性验证。四、标准编制背景与修订历程4.1历史沿革ISO6888-1的制定工作始于20世纪70年代末期，其技术基础源于Baird-Parker于1962年开发的经典选择性培养基配方。1969年，Baird-Parker对原始配方进行了改良，加入了亚碲酸钾和卵黄乳液，显著提高了培养基对CPS的选择性和鉴别能力，这一改良配方被广泛接受并沿用至今。|版本|发布时间|主要变化||------|----------|----------||ISO6888:1983|1983年|首次发布，作为独立的单部分标准||ISO6888-1:1999|1999年|拆分为系列标准，增加第2、3部分||ISO6888-1:1999/Amd1:2003|2003年|修订了培养基质量控制要求||ISO6888-1:2021|2021年8月|现行版本，全面修订，与ISO7218和ISO11133保持协调|4.2现行版本主要修订内容与1999版相比，ISO6888-1:2021的主要技术变化包括：第一，标准结构进行了全面调整，引入了ISO7218:2016和其他通用标准中定义的术语和定义，删除了已在通用标准中规定的内容，避免了重复和冲突。第二，增加了“试剂和材料”章节的详细规定，对培养基成分、试剂纯度等级（如分析纯级）、关键试剂的配制方法（如卵黄亚碲酸盐乳液的制备）进行了更为明确和细化的规定。第三，引入了ISO11133对培养基质量控制的规范性引用，强化了培养基性能验证的要求，增加了对培养基贮存条件、有效期和质量控制试验频次的具体规定。第四，对结果计算和不确定度评估的要求进行了更新，与ISO19036（测量不确定度的估算）保持一致，要求实验室在报告结果时考虑测量不确定度的影响。第五，增加了资料性附录，提供了关于Baird-Parker琼脂培养基上CPS菌落形态特征的图解说明和各类型食品基质的方法性能验证数据。五、标准参与编制单位介绍5.1国际标准化组织食品微生物学技术委员会（ISO/TC34/SC9）ISO/TC34/SC9是国际标准化组织下设的专门负责食品微生物学领