重组人干扰素注射剂质量标准HS20010015

注射用重组人干扰素a-2b（甘乐能）质量标准Interferonalfa-ab(IntronA)forInjection编号JS200200211外观应为白色或微黄色疏松体，加入1ml灭菌注射用水后能迅速溶解，且不得含有肉眼可见的不溶物。pH值按《中国生物制品规程》（2000版）测定，pH值应为6.5-7.5水分含量按《中国生物制品规程》（2000版）测定，应≤3.0%。效价规定按《中国生物制品规程》（2000版）测定，采用WISH细胞-VSV病毒系统(见附录1)，其效价应为标示量的80-150%。无菌试验按《中国生物制品规程》（2000版）测定，应合格。异常毒性试验按《中国生物制品规程》（2000版）测定，小鼠检测项进行测定，应合格。细菌内毒素含量按《中国药典》（2000版）方法测定，内毒素含量应≤10.0EU/支。鉴别试验SDS凝胶电泳测定，迁移率与标准品一致，方法见附录2。【规格】500万IU/支【生产国别及生产厂】爱尔兰先灵葆雅有限公司【复核单位】中国药品生物制品检定所附录(1)微量病毒抑制（WISH/VSV）法原理：IFN效价测定采用微量病毒抑制(WISH/VSV)法。IFN可以保护人羊膜细胞（WISH）免受滤泡性口炎病毒（VSV）破坏。用结晶紫对存活WISH细胞染色，可以得到IFN对WISH细胞的保护效应曲线。按50%保护点的稀释倍数可以折算为待检验品中IFN的效价，测定结果需用IFN国家标准品校正。材料和试剂：（所用试剂均需分析纯或与指定产品相当）2.1MEM培养液：GIBCO产品，按说明书配制，置于玻璃或塑料瓶中，4℃条件下保存。使用期限不得超过产品标示有效期。2.2牛血清：无支原体，杭州四季青生物工程研究所生产，中国药品生物制品检定所监制。2.3完全培养液：MEM培养液添加10%牛血清。2.4测定培养液：MEM培养液添加7%牛血清。2.5攻毒培养液：MEM培养液添加3%牛血清。2.6消化液：取0.2gEDTA、8gNaCl、0.2gKCl、1.152gNa2HPO4、0.2gKH2PO4用双蒸水配成1000ml的溶液，经121℃、15分钟高压灭菌。2.7染色液：50mg结晶紫加入20ml乙醇溶解，用蒸馏水定容至100ml。2.8脱色液：50%乙醇，50%蒸馏水，0.1%乙酸（V/V）。2.9标准品：IFN效价测定用国家标准品，03/94（12000IU/支）。2.10PBS缓冲液：取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4用蒸馏水配成1000ml的溶液，经121℃、15分钟高压灭菌。2.11WISH细胞（人羊膜细胞）：WISH细胞在培养基中呈单层，贴壁生长，每周二次，1/4消化传代，于完全培养基中生长。2.12VSV病毒（滤泡性口炎病毒）：-70℃保存。3.设备和器材：按实验室和设备规范进行准备和检查。4.实验操作：（4.1.~4.7.各步骤应于无菌条件下进行）（第一天）4.1.铺板：弃去WISH细胞培养瓶中的培养基，用PBS缓冲液涮洗二次后消化和收集细胞，用完全培养液配成2.5-3.5×105/ml的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl。37℃，5%CO2条件下培养小时。4.2.制备样品溶液：取1支标准品按说明书配成标准样品溶液。取规定数量的待检样品按说明书配成待检样品溶液。4.3.制备样本溶液：根据情况用测定培养基将效价高于103IU/ml的待检样品溶液稀释至约103IU/ml，每步稀释不得超过10倍。按以上预稀释程序制备的溶液称为样本溶液。效价低于103IU/ml的待检样品溶液和标准样品溶液作为样本溶液直接制备样本梯度。4.4.制备样本梯度：于96孔细胞培养板中每孔加入150μl测定培养液。在A6、A7各孔中每孔加入50μl标准样本溶液，在A2、A3;A4、A5;A8、A9;A10、A11各孔中每孔加入50μl各待检样本溶液，每个待检样品做2个复孔。自A行取50μl至H行作4倍稀释，每孔留150μl余液。4.5.加样：取4.1.制备的细胞培养板，弃去上清。将4.4.制备的实验样本梯度移入该细胞培养板,每孔100μl。其中，标准样本梯度和较高效价待检样品的待检样本梯度移取43~48梯度；较低效价待检样品的待检样本梯度移取41~46梯度。37℃，5%CO2条件下培养小时。（第二天）4.6.制备病毒液：攻毒剂量为100TCID50，取保存的VSV病毒用攻毒培养液稀释至工作浓度。4.7.攻毒：取4.5.制备的细胞培养板，弃去上清。加入病毒液，每孔100μl。37℃，5%CO2条件下培养24~36小时（镜检标准样本的50%病变点在D或E行）。（第三天）4.8.染色：轻轻吹打96孔细胞培养板各孔2~3次，弃去上清（于特制容器内，并做消毒处理）。每孔加入30μl染色液，室温放置30分钟。4.9.脱色：流水小心冲去染色液，吸干残留水分。每孔加入100μl脱色液，室温放置3~5分钟。4.10.比色：测定波长570nm，参比波长630nm，记录测定结果。5.结果处理：5.1.计算实验结果：对各实验样品的各实验点O.D.值、预稀释倍数、样本梯度等数据采用计算机程序*********进行处理。分别计算各实验样品的半效稀释倍数，即从样本溶液至相当于标准品50%最大效应点的稀释倍数，并按下式计算实验结果：待检样品预稀释倍数待检样品半效稀释倍数待检样品效价=标准品效价×━━━━━━━━━━━×━━━━━━━━━━━标准品预稀释倍数标准样品半效稀释倍数附录（2）SDS━PAGE凝胶电泳试剂：（所用试剂均需分析纯）1.1.超纯水：电阻率应不低于13MΩ·CM。A液（1.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，Tris-Hcl，PH8.8）：取18.15g三羟甲基氨基甲烷加适量超纯水溶解，用浓盐酸调PH至8.8，加超纯水定容至100ml。B液（30%丙烯酰胺-0.8%N,N'–甲叉双丙烯酰胺）：取30g丙烯酰胺，0.8gN,N'–甲叉双丙烯酰胺加超纯净水溶解至100ml，待其完全溶解后用滤纸过滤，避光保存。1.4C液（1%十二烷基磺酸钠，SDS）：取1g十二烷基磺酸钠，加超纯水溶解至100ml，室温保存。1.5.D液（10%四甲基乙二胺）：取10ml四甲基乙二胺，加超纯水定容至100ml。1.6.E液（10%过硫酸铵）：取100mg过硫酸铵，加超纯水溶解至1ml。F液（0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，PH6.8）：取6.05g三羟甲基氨基甲烷加适量超纯水溶解，用浓盐酸调PH至6.8，加超纯水定容至100ml。电极缓冲液：取3g三羟甲基氨基甲烷，14.4g甘氨酸，1g十二烷基磺酸钠加适量超纯水溶解，用浓盐酸调PH至8.3，加超纯水定容至1000ml。1.9.样品缓冲液：取0.303g三羟甲基氨基甲烷，0.189ml盐酸，4ml甘油，2mg溴酚蓝，加超纯水溶解至10ml。（如用于非还原SDS，应再加0.8g十二烷基磺酸钠；用于还原SDS，则加0.8g十二烷基磺酸钠，2mlβ-巯基乙醇）1.10.蛋白质标准，样品的分子量应包括在使用的分子量标准范围之内。1.11.固定液：取250ml甲醇，60ml冰醋酸，加超纯水至500ml。1.12.漂洗液：取100ml乙醇，50ml冰醋酸，加超纯水至1000ml。1.13.辅染液：取10g重铬酸钾，2ml硝酸加适量超纯水溶解，定容至200ml。用前40倍稀释。1.14.银染液：取2.04g硝酸银加超纯水溶解至1000ml。1.15.显色液：取0.5ml甲醛，30g碳酸钠加适量超纯水溶解，定容至1000ml。1.16.终止液：取10ml冰醋酸加超纯水至1000ml。1.17.考马斯染色液：取1g考马斯亮蓝R-250，200ml甲醇，50ml冰醋酸，加蒸馏水溶解至500ml。1.18.考马斯脱色液：取400ml甲醇，100ml冰醋酸，加蒸馏水至1000ml。2.操作：2.1.制备分离胶：将配好的分离胶灌入电脉槽中（配方见下表），加水覆盖，室温下聚合（室温不同，聚合时间不同）。PAGE凝胶配方凝胶浓度（%）分离胶浓缩胶5%7.5%10%12.5%15%17.5%4.5%A液B液C液D液E液F液H2O4444442.745.46.789.41.61.61.61.61.61.60.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.17.364.883.32.280.881.350.90.070.072.254.332.2.制备浓缩胶：待分离胶聚合后，用滤纸吸去上面的水层，再灌入浓缩胶（配方见上表），插入样品梳，注意避免气泡出现。2.3.样品处理：将待测样品与样品液按3：1的比例混匀，100℃水浴3–5分钟。加样：待浓缩胶聚合后拔出样品梳，将电极缓冲液注满电泳槽前后槽，在加样孔中加入样品5ug。电泳：接通电源、冷凝水，以恒流10mA开始电泳，至样品进入分离胶后将电流调至20mA，直至电泳结束。染色方法1（银染法）2.6.固定：将电泳后的凝胶取下，浸入固定液中，过夜。2.7.漂洗：将凝胶自固定液中取出，用漂洗液漂洗三次，每次10分钟。2.8.辅染：将漂洗后的凝胶浸于辅染液中7–10分钟。2.9.清洗：将凝胶自辅染液中取出，用超纯水清洗三次，每次2分钟。2.10.银染：将清洗后的凝胶浸于银染液中，置较强日光或类似光源下照射30分钟，再于正常光线下放置20分钟。2.11.清洗：将凝胶自银染液中取出，用超