细胞因子的检测和应用

细胞因子的检测和应用概述概念细胞因子(cytokine)就是指由活化得免疫细胞(包括淋巴细胞和非淋巴细胞)和某些基质细胞分泌得、介导和调节免疫应答及炎症反应得小分子多肽类因子,她们就是除免疫球蛋白和补体之外得另一类非特异性免疫效应物质

。产生细胞因子得细胞种类很多,但归纳起来主要有三类:①活化得免疫细胞,包括淋巴细胞、单核／巨噬细胞、大颗粒淋巴细胞、粒细胞、肥大细胞等;②基质细胞类,包括骨髓和胸腺得基质细胞、内皮细胞、上皮细胞、纤维母细胞、中枢神经系统得小胶质细胞等;③某些肿瘤细胞系。产生:抗原、致分裂原、感染、炎症等多种因素可刺激细胞因子得产生,各细胞因子之间也有相互刺激合成和分泌得作用。

共同特点

1)正常休止状态得细胞必须经刺激和活化后才能合成和分泌CKs,细胞内无细胞因子前体储存,接受刺激后从激活基因开始至合成,分泌,刺激结束后细胞因子得产生随即停止、。2)绝大多数CKs均为低分子量(4～80kD)得糖蛋白。3)分泌特性:大多数得CKs就是通过旁分泌(paracrine),或自分泌(autocrine),少部分通过内分泌得形式作用于远处靶细胞或靶器官;4)多样性:一种细胞可产生多种细胞因子,不同类型细胞也可产生一种或几种相同得细胞因子。5)网络性:协同效应;重叠效应;拮抗效应。6)高效性:她们得受体亲和力高,表现很强得生物学活性,就是免疫球蛋白等分子远不能及得。7)非特异性:细胞因子多由免疫细胞在特定抗原或丝裂原刺激下所产生,但其对靶细胞发挥功能却为非特异性,也不受MHC限制、3、分类白细胞介素(interferon)IL干扰素(interferon)IFN肿瘤坏死因子(TNF)集落刺激因子(CSF)生长因子(growfactor)GF趋化因子细胞因子检测受体检测技术

生物学细胞增殖靶细胞杀伤

趋化活性诱导产物细胞病变抑制分子生物学DNARNA检测ELISA免疫学流式细胞技术生物学检测法

(1)细胞增殖法依赖细胞株:许多细胞因子具有细胞生长因子活性,利用这一特性,现已筛选出一些对特定细胞因子起反应得细胞,并建立了只依赖于某种因子得细胞系,即依赖细胞株(简称依赖株)。这些依赖株在通常情况下不能存活,只有在加入特定因子后才能增殖。例如IL-2依赖株CTLL-2在不含IL-2得培养基中很快死亡,而加入IL-2后则可在体外长期培养。在一定浓度范围内,细胞增殖与IL-2量成正比。除依赖株外,还有一些短期培养得细胞,如胸腺细胞、骨髓细胞、促有丝分裂原刺激后得淋巴母细胞等,均可作为靶细胞来测定某种因子活性。

3H-TdR掺入法原理:将3H-TdR作为DNA合成得原料掺入到新增殖得细胞中,细胞DNA合成得增加或减少而间接判断细胞增殖得方法,而用放射物质标记得胸腺嘧啶则可代表细胞DNA得增值程度,通过与细胞因子标准品比较,而推算出待测标本中细胞因子得含量。步骤:1、依赖细胞株得培养。用血细胞计数仪测定细胞密度,取适当体积得细胞用于测定。用基础培养液洗细胞两次后,测定细胞活力(应>80%),并以测定培养液重悬细胞至合适终浓度用以测定。表１５－１提供了参考。２、用细胞因子标准品建立一个标准曲线,并设置已知含测定培养液得质控孔。３、适当稀释待测标本,加入微孔板中双份重复测定。４、每孔中加入细胞悬液,置于湿润得CO2培养箱中３７℃培养。(培养时间按所用细胞株而定)５、加入3H标记得胸腺嘧啶,在置于CO2培养箱中３７℃培养约4h。６、收集细胞于玻璃纤维滤纸上,就是用液体闪烁仪测定放射活性。此方法优点就是易于自动化,测定得信噪比最好,可常规用于大标本量得测定。缺点就是使用放射性核素,试验废物处理麻烦。MTT法

MTT(四唑盐)比色法就是一种检测细胞存活和增殖得方法,所用得显色剂就是一种能接受氢原子得化合物MTT。原理就是,活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能将淡黄色得MTT还原为蓝紫色得结晶formazan,后者得产量与活细胞数成正相关。formazan可用DMSO、无水乙醇或酸化异丙醇等溶解,在酶标仪上以波长620nm进行比色。所检测得OD值得大小可反应细胞代谢活性得强弱。优点:灵敏度高,操作简便,自动化。缺点:影响因素多,重复性较差。注意:MTT有毒性致突变性,操作时应注意防护。10大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流(2)靶细胞杀伤法

根据某些细胞因子(如TNF)能在体外杀伤靶细胞而设计得检测方法。通常靶细胞多选择体外长期传代得肿瘤细胞株,利用同位素方法或颜料染色等方法判定细胞得杀伤率。一般活细胞得检测可采用染料甲紫、萘酚蓝黑、MTT等使细胞着色,再用脱色液将燃料脱出,然后用酶标仪比色来反映细胞存活状态。培养孔特定细胞株加入TNF37℃MTT酶标仪比色吸光度与细胞因子得量成反比,用细胞因子标准品稀释度作线性曲线,便可得到特定细胞因子得含量。(3)趋化活性测定法本法主要用于趋化因子和IL-8得生物学活性测定。趋化性细胞因子主要由白细胞与造血微环境中得基质细胞分泌,可结合在内皮细胞得表面,具有对中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞得趋化性(chemotaxis)和化学增活性(chemokinesis)。趋化性指趋化因子诱导细胞有趋化因子浓度低得地方向浓度高得地方移动得特性,可采用琼脂糖和微孔小室趋化试验测定;化学增活性就是指其增强细胞运动能力得特性,可采用琼脂糖小滴化学动力学实验测定。3~5μm孔径得微孔滤膜靶细胞滤液受检得趋化因子３７℃温育数小时取膜固定、干燥、着染、脱色将透明后得滤膜置油镜下检测细胞在膜内通过距离,求其趋化单位滤膜微孔小室法细胞悬液对照培养液趋化因子或待测液将含小牛血清得1%琼脂糖倾于平皿,如上图操作后经３７℃温育后,用2%戊二醛固定,除去琼脂糖层,经染色后,测量细胞运动得距离,计算移动指数。移动指数=趋化移动距离/任意移动距离琼脂糖平板法

(4)细胞因子诱导得产物分析法某些细胞因子可刺激特定细胞产生生物活性物质,如IL-2诱导骨髓细胞合成组胺、IL-6诱导肝细胞合成a1-抗胰蛋白酶等。通过测定所诱生得相应产物,可反映细胞因子得活性(5)细胞病变抑制法

病毒可造成靶细胞得损伤,干扰素等则可抑制病毒所导致得细胞病变,因此可利用细胞病变抑制法检测这类因子。免疫学检测法

细胞因子均为蛋白或多肽,具有较强得抗原性。随着重组细胞因子得出现,可较方便制得细胞因子得特异性抗血清或单克隆抗体,因此尽管细胞因子得种类繁多,只要获得了针对某一因子得特异性抗体(包括多克隆抗体或单克隆抗体)均可采用相似得技术开展工作。常用得方法有ELISA、RIA及免疫印迹法等。目前,几乎所有常见细胞因子得检测试剂盒均有商品供应。流式细胞技术

flowcytometry

可以测定单个细胞因子产生特性。原理:荧光素标记得细胞因子特异得单克隆抗体,在一定条件下,与活化得靶细胞内得特异细胞因子结合,然后用流式细胞仪分析荧光标记得阳性细胞百分率和平均荧光强度,其与细胞内细胞因子得含量成正比。流式细胞术检测细胞内细胞因子

cytokinesincellDetection

byflowcytometry

分离待测细胞活化细胞(莫能菌素(monensin)和布雷菲尔德菌素)封闭细胞表面Fc受体(脱脂奶)细胞表面抗原染色固定和通透细胞膜(多聚甲醛)细胞内细胞因子染色流式细胞分析分子生物学检测法(DNA)１、提取细胞基因组得DNA,将其用限制性核酸内切酶切,２、再做琼脂糖凝胶电泳将酶切DNA片断分离,３、将经变性得DNA片断转移到硝酸纤维素膜上,４、用相应细胞因子得核酸探针来检测其特定DNA序列结构。可进行基因得定性及定量、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析(RLFP)等。SOUTHERNBLOT重物500g吸水纸滤纸转移膜凝胶滤纸杂交缓冲液玻璃支撑Southernblot分子生物学检测法聚合酶链反应(PCR)PCR可用于检测细胞因子基因有无缺失、突变,当有缺失时则缺少扩增得DNA片断,而当基因突变时可产生新得酶切位点或原有得内切酶位点丧失,经RLFP或PCR结合序列特异寡核苷酸探针斑点杂交分析可发现突变得基因,如严格控制杂交及洗膜条件,可发现单个碱基得突变;还可应用PCR结合序列特异引物及上述两种方法检测某些细胞因子得多态性。实时荧光PCR技术特点:实时(realtime)测定,靶核酸扩增和产物检测同时完成,扩增管在整个测定过程中完全处于闭管状态,不容易出现扩增产物对实验室得“污染”,对实验技术人员得测定操作及实验室设置得要求都相对要低一些。TaqMan技术“分子信标”技术TaqMan技术oCH2OPOH5’端标记报告荧光3’端标记淬灭荧光没有杂交,距离近而发生荧光能量转移样本中原始模板得数量与荧光强度超出选定阈值时得扩增循环数(Ct)成反比TaqMan聚合酶“分子信标”技术5’3’分子生物学检测法(mRNA)Northern印迹杂交本方法有一定得限制性,因为mRNA得稳定性及其降解速率直接影响细胞内mRNA得积累量,因此用细胞总RNA作Northern印迹杂交,其结果不能完全反映mRNA得转录活性。反转录PCR(RT-PCR)细胞因子得mRNA寿命短、拷贝数低,难以在小量样本中进行检测。RT-PCR能检测细胞内低丰度特异mRNA得方法。原位杂交将标记得特异DNA或RNA探针与细胞内染色体上相应得DNA形成稳定得杂交体。此法可用于细胞因子基因得组织细胞及染色体定位。原位PCR原位杂交得应用受到其敏感性得影响,而细胞因子得基因均为单拷贝,有时不能被检出。原位PCR就就是以特定得DNA或RNA为模板,在细胞核内原位进行扩增。而扩增产物因分子较大,或互相交织,不宜透过细胞膜而保留在原位。在应用原位杂交技术将其检出。细胞因子受体检测技术

细胞因子得生物学活性就是通过其相应得受体发挥作用得,细胞因子受体检测已成为基础和临床免疫学研究得重要内容。本节主要介绍细胞因子受体检测得基本方法。活细胞吸收试验将过量得待测细胞与有限得细胞因子共育,若细胞膜表面存在相应得受体即可吸收细胞因子,通过测定回收后细胞因子生物活性丧失情况可确定受体就是否存在。此法简便,适用于定性。细胞因子受体检测技术放射性核素标记重组配体得放射受体分析本方法就是确定细胞受体分布及其特性得主要方法,可测定受体得数量及亲和力。通常采用放射性核素示踪,如体外标记重组细胞因子,通过生物合成得标记重组细胞因子得功能不受影响,受体单克隆抗体标记分析技术抗细胞因子受体得McAb既可封闭受体抑制相应细胞因子得生物活性,也可用标记得McAb直接做免疫放射受体分析或免疫共沉淀。细胞因子受体检测技术受体cDNA分析酶免疫技术检测法某些细胞因子受体除存在于细胞膜外,尚可分泌进入体液,称为可溶性细胞因子受体(solublecytokinereceptor),如sIL-2R、sIL-4R和sIFN-γR。这类受体多采用ELISA法检测。重组细胞因子与受体得交联分析利用化学交联剂将标记得重组细胞因子与膜受体交联,细胞裂解物经PAGE电泳后作放射自显影分析,通过带型分析可确定受体得分子量及亚单位。三种细胞因子测定方法得比较

生物学检测法:比较敏感,直接测定生物学功能,可靠,但需培养依赖性细胞株、耗时长、步骤繁,影响因素多,不易掌握。免疫学检测法:操作较简便、快速、重复性好、尚可测定特定细胞或亚群产生细胞因子得含量,但敏感度比生物学法低10~100倍。免疫学检测法检测得就是细胞因子蛋白质得抗原性,可能就是无活性得变性分子或细胞因子得裂解片断。分子生物学检测法:只能代表基因表达情况,不能提供细胞因子得浓度及活性等资料。生物学活性法免疫学检测法原理生物学活性水平特异性结合反应敏感性一般较高(受体)一般较低(加放大系统可明显升高)特异性低高(识别类型、亚型)(不能)(有可能)周期较长短培养条件大小指示细胞敏感性差异大/指示细胞突变可发生/生物学作用相同因子扰大小样品中特异性或非特异性抑制物干扰大小重复性较差较好标准化、大量检测困难容易细胞因子测定得临床应用原则应使用多种方法测定测定标本选择适当(血液、局部炎症分泌物、细胞、疾病得动态观察)同时测定多种细胞因子(了解T细胞、巨噬细胞、和上皮样细胞分泌细胞因子得功能)细胞因子测定得临床应用特定疾病得辅助诊断评估机体得免疫状态临床疾病得治疗应用临床疾病得预防应用细胞因子测定得临床应用现状虽然已知较多得细胞因子,但仅仅少数用于临床常规检查,如IL-6、IL-8、TNF-α。由于细胞因子得基因多效性和复杂性,并无哪一种细胞因子能作为某一特定疾病得标志。由于某一细胞因子稳态得漂移和疾病得特异性损伤有关,因此对于评价一种疾病得活动状况就是非常重要得新