药品生物检定技术（第2版）课件 第三篇 第十二章 酶类药物的生物活性检定

第十二章酶类药物分析目录01概述02胃蛋白酶的活力测定学习目标1.掌握酶类药物的基本概念、分类。2.掌握酶类药物典型代表——胃蛋白酶的活力测定方法，理解其测定原理。3.熟悉酶类药物鉴别、检查、活力测定的常用方法。知识目标1.独立且规范进行胃蛋白酶的活力测定操作。2.结合酶类药物的性质，根据《中国药典》对该类药物进行鉴别、检查和活力测定。能力目标1.提高遵守药品国家标准、法律法规的自觉意识。2.养成严守标准、严谨求实的科学精神。素养目标1783年，意大利科学家斯巴兰让尼设计了一个巧妙的实验：将肉块放入小巧的金属笼内，然后让老鹰把小笼子吞下去，这样，肉块就可以不受胃的物理性消化的影响，而胃液却可以流入笼内。

过一段时间后，他把小笼子取出来，发现笼内的肉块消失了。于是，他推断胃液中一定含有消化肉的物质。第一节概述一、酶类药物概述1.概念：生物体内一类具有催化活性和特定空间构象的生物大分子，包括蛋白质和核酸等。2.分类助消化酶类

胃蛋白酶等蛋白水解酶类

糜蛋白酶、溶菌酶等凝血酶及抗栓酶

尿激酶、链激酶等抗肿瘤酶类L-天冬酰胺酶等其他酶类

细胞色素C、SOD、抑肽酶等辅酶：CoQ10等。二、酶类药物鉴别（一）蛋白质显色反应：双缩脲反应（二）酶活性试验：酶与特异性底物结合（三）沉淀试验：酶与有机酸或重金属盐反应（四）动物试验：动物体内某些指标或特征变化（五）标准品对照法：供试品与相应标准品同法测定、对比。三、酶类药物检查

酶类药物的检查项目有多项与一般生物化学药物的检查项目和检查方法相同。如酸碱度、溶液的澄清度与颜色、干燥失重、炽灼残渣、重金属、热原、异常毒性、降压物质等。其他检查项目：

（一）脂肪含量限度检查（二）其他酶类含量限度检查（三）大分子活性物质含量限度检查四、酶类药物活力测定

酶的活性效价由其氨基酸序列及空间结构决定，往往与酶的绝对质量不一致。因此，与化学药物以含量测定结果评价药效不同，酶类药物的药效评定不能直接用重量单位来确定。如果一种酶失去了生物学活性，那么即使绝对质量再多，也无法发挥作用，因此酶的定量只能用酶活力来表示。（一）酶的活力单位酶活力指酶催化生化反应的能力，是反映酶活性的指标，其大小可以用一定条件下酶所催化的某一化学反应的反应速率来表示：以酶作用后底物或产物浓度的变化值为检测指标，进而计算该酶制品的酶活力。酶的活力单位用以量度酶活力的大小，用U表示。（二）酶活力测定的原理酶活力测定是酶法分析中的重要内容之一。进行酶法分析时，第一步是进行酶促反应，即将酶与相应底物接触，并在适当条件下（温度、pH等）进行催化反应；第二步是测定酶促反应前后的物质变化情况，如检测底物浓度的减少量、产物浓度的增加量、辅酶的浓度变化等。常用的酶法分析包括终点法、速度法和酶循环放大分析法。1.终点法（1）单酶反应定量法①底物减少量的测定②产物增加量的测定③辅酶变化量的测定（2）和指示酶反应偶联的定量法①当被分析的反应产物和底物无法用物理化学手段区分时，可借助酶的特异反应来加以识别。在这种情况下，如该酶可用作指示酶反应，就有可能通过和它偶联进行定量分析。②如果所用酶的专一性不强，同时样品中还夹杂有可作为它们底物的其他物质，这时单用一种酶很难进行定量，需要再偶联一个酶，通过偶联酶的专一性才能实现区别定量。2.反应速度法（1）一般反应速度测定法：测定底物、辅酶或抑制剂的含量。（2）特殊的反应速度测定法：偶联，测定第三种指示剂酶的反应速度。3.酶循环放大分析法

酶法分析因具有较强的特异性和很高的灵敏度，一直是生物药物定量分析的常用方法。然而，对于含量极微少的物质，若采用酶法直接定量，却受到灵敏度的限制，甚至不能采用常规的终点法。因此，采用酶循环放大法则可进行测定。酶循环放大法仍然利用酶对底物的专一性，使微量的底物“增幅放大”以达到定量分析目的。从理论上讲，酶法分析这种化学性放大作用可无限放大。目前，酶循环放大分析法定量限度可达10-15～10-18mol。（三）酶活力测定的方法按酶法分析方法测定酶活性时，需要跟踪酶促反应中某一反应底物或产物的浓度随时间发生的变化量（速度法），或测量酶促反应中反应产物或底物浓度的总变化量（终点法）。可针对某些易于测定的酶促反应底物或产物（如H+、OH-、ATP、CO2、H202等）选择具体的检测方法，包括容量分析法、气体检测法、光学检测法、黏度测定法、酶联免疫法等。

1.容量分析法若酶促反应中，反应底物或产物之一具有特定电化学性质，可以采用相应的某种已知准确浓度的试剂溶液（滴定液）对其进行滴定，直到所加的滴定液与被测的反应底物或产物按化学计量关系完全反应为止，然后根据消耗的滴定液的浓度和用量，计算出反应底物或产物的含量，进而推算出酶的活力。例如抑肽酶的测定。2.气体检测法若酶促反应能产生气体时，可以将生成气体的变化量作为检测指标，计算酶的活力。例如尿激酶的测定。3.分光光度法若酶促反应中，反应底物或产物之一由于化学结构的改变，其吸光度的强度发生变化，可以通过测定该酶促反应系统的吸光度的变化量，推算出酶的活力。多数酶类药物的含量检测（效价测定）均采用分光光度法，如胃蛋白酶、糜蛋白酶、门冬酰胺酶、溶菌酶等。例如糜蛋白酶的测定。4.粘度测定法若酶促反应中，反应产物或底物之一具有某种可以指示反应变化的物理特性，也可利用其物理特性的改变来测定酶的活力。例：英国药典，玻璃酸酶。第二节胃蛋白酶的活力测定胃蛋白酶概念：

胃蛋白酶原胃蛋白酶作用原理：蛋白质小肽、酪氨酸、苯丙氨酸胃酸活化

水解来源：猪、牛、羊胃中提取；性状:白色或淡黄色的粉末，无霉败臭，有引湿性，水溶液显酸性反应；鉴别:水溶液加鞣酸、没食子酸或多数重金属盐的溶液，可产生沉淀；保存：

在低温环境中（-20℃至-80℃）保存，以防止其发生自降解，或储存于pH11的溶液中或对其进行还原性甲基化也可以有效防止自降解的发生，当pH6时，胃蛋白酶的活性即可恢复；临床应用：

消化不良；消化性溃疡禁用此药。胃蛋白酶活力测定原理：

用血红蛋白作为底物，在规定的实验条件下，利用胃蛋白酶催化水解血红蛋白生成水解产物（小肽及酪氨酸等氨基酸），准确反应一定时间。在一定范围内，其溶液紫外吸光度与胃蛋白酶活力成一定比例，用酪氨酸作对照品，以确定胃蛋白酶的活力单位。试剂：

盐酸溶液血红蛋白试液三氯醋酸溶液溶剂底物终止反应对照品溶液、供试品溶液的制备：对照品对照品供试品浓度约为0.5mg/ml的酪氨酸对照品溶液每1ml中约含0.2～0.4单位的供试品溶液测定法：37℃±0.5℃水浴

对照品3支供试品3支对照品空白供试品空白测定法：

取试管6支，其中3支各精密加入对照品溶液1ml，另3支各精密加入供试品溶液1ml，置37℃±0.5℃水浴中，保温5分钟，精密加入预热至37℃±0.5℃的血红蛋白试液5ml，摇匀，并准确计时，在37℃±0.5℃水浴中反应10分钟，立即精密加入5%三氯醋酸溶液5ml，摇匀，滤过，取续滤液备用。

另取试管2支，各精密加入血红蛋白试液5ml，置37℃±0.5℃水浴中保温10分钟，再精密加入5%三氯醋酸溶液5ml，其中1支加供试品溶液1ml，另1支加上述盐酸溶液1ml，摇匀，滤过，取续滤液，分别作为供试品和对照品的空白对照，照紫外-可见分光光度法，在275nm的波长处测定吸光度，算出平均值`As和`A。计算公式：式中，`As为对照品的平均吸光度；

A为供试品的平均吸光度；

Ws为每1ml对照品中含酪氨酸的量，μg；

W为供试品取样量，g；n为供试品稀释倍数。

在上述条件下，每分钟能催化水解血红蛋白生成1μmol酪氨酸的酶量，为一个蛋白酶活力的单位。

注：按干燥品计算，每1g中含胃蛋白酶活力不得少于3800单位。