药品生物检定技术（第2版）课件 第1-5章 药品生物检定基础知识与基本操作-热原及细菌内毒素检查

第一章药品生物检定基础知识与基本操作目录01药品生物检定技术概述02生物检定用培养基03生物检定用菌毒种及动物细胞的质量控制04药品生物检定技术基本操作05实验动物操作技术学习目标1.掌握药品生物检定技术的概念。2.掌握培养基的概念、分类和配制过程。3.熟悉生物检定用菌毒种概念和分类、动物细胞的概念和检定项目。4.熟悉实验动物操作技术。知识目标1.学会配制各类培养基的方法。2.规范、熟练进行微生物的接种操作。能力目标1.树立生物检定过程中的安全操作意识。2.培养耐心细致、严谨务实的职业态度。素养目标第一节药品生物检定技术一、药品生物检定技术的概念药品生物检定技术是利用药物对生物体包括整体动物、离体组织、器官、细胞和微生物等，所产生的药理作用或者毒理作用以及其他反应来测定药品的有效性（即生物活性或效价）、安全性（即毒性或某些有害物质限度检查、无菌检查等），以及研究药物的量效关系，是反映药品的临床功能、效价和安全的一门学科。二、药品生物检定技术的任务（一）药品的生物活性测定《中国药典》（2025年版）收载了激素类药品的生物检定法、抗生素类药品的微生物检定法、酶和蛋白的生物检定法，还收载了菌苗、疫苗、抗毒素、类毒素、单克隆抗体等药品的效力测定法。（二）药品的安全性检查无菌检查微生物限度检查细菌内毒素检查异常毒性检查其他（三）检验方法的核对用生物检定法来核对理化检验方法是否可靠。（四）神经介质、激素及其他微量生理活性物质的测定采用理化检验方法测定某些神经介质、激素或其他微量生理活性物质的浓度，具有高效快速等优点，但这些物质具有微量、生理活性强的特点，生物检定法往往具有更高的灵敏度和专一性。此外，生物检定法一般对样品的纯化要求不高，在样品处理上较理化方法的要求更低。第二节生物检定用培养基一、培养基的概念和分类（一）培养基的概念培养基是人工配制的生物营养物质，即用人工方法将多种物质按各种微生物生长繁殖的需要配制成的一种混合营养物质，用于细菌的培养、分离、鉴定、研究和保存。（二）培养基的分类

1．按物理性状分可分为液体、流体、固体、半固体4种。常用固体培养基有平板、斜面2种。2．按用途分可分为基础培养基、选择培养基、增菌培养基和鉴别培养基等，或分为需氧菌检查用培养基、霉菌检查用培养基、酵母菌检查用培养基、厌氧菌检查用培养基等。二、培养基的制备过程1．容器要求

玻璃器皿或搪瓷，禁用金属容器。2．称量与溶解

根据处方要求配制。3．校正pH一般高压灭菌前应比最终pH高0.2~0.3（验证）。4．分装

不同类型培养基分装要求不同。5．灭菌

一般采用高压蒸汽灭菌（121℃20min或115℃30min）6．储存

干粉（阴冷干燥处）；配制好的培养基（2~25℃）。第三节生物检定用菌毒种及动物细胞的质量控制一、生物检定用菌毒种的管理及质量控制1.概念

生物制品检定用菌毒种系指直接用于检定生物制品的细菌、真菌、支原体、放线菌、衣原体、立克次体或病毒等，包括各种经过基因工程修饰的菌毒种。检定用菌毒种其来源途径应合法，并经国家药品监督管理部门批准，应确保其生物学特性稳定，并且适用于检定要求。2.分类

以中国《人间传染的病原微生物目录》为基础，根据病原微生物的传染性、感染后对个体或群体的危害程度，将菌毒种分为四类。01第一类病原微生物系指能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，以及中国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物。03第三类病原微生物系指能够引起人类或者动物疾病，但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害，传播风险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，并且具备有效治疗和预防措施的微生物。02第二类病原微生物系指能够引起人类或动物严重疾病，比较容易直接或间接在人与人、动物与人、动物与动物之间传播的微生物。04第四类病原微生物系指在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物。无菌检查微生物限度检查3.菌毒种的保存与销毁保存销毁菌毒种经检定后，应根据其特性，选用冻干、液氮、≤-60℃冻存或其他适当方法及时保存。不能冻干、液氮、≤-60℃冻存的菌毒种，应根据其特性，置适宜环境至少保存2份或保存于两种培养基。保存的菌毒种传代、冻干、液氮、≤-60℃冻存均应填写专用记录。销毁一、二类菌毒种的原始种子、主种子批和工作种子批时，须经本单位领导批准，并报请国家卫生行政主管部门或省、自治区、直辖市卫生行政主管部门认可。销毁三、四类菌毒种须经单位领导批准。销毁后应在账上注销，作出专项记录,写明销毁原因、方式和日期。二、生物检定用动物细胞的质量控制1.概念

检定用动物细胞系指用于生物制品检定的细胞，包括原代细胞、连续传代细胞或二倍体细胞，以及经特定基因修饰过的细胞。细胞鉴别试验细胞形态、生物化学法、免疫学检测、细胞遗传学检测、遗传标志检测以及其他方法。支原体检测第一法（培养法）。支原体液体培养基、半流体培养基，36℃±1℃，如接种供试品的培养基均无支原体生长，则供试品判为合格。细菌、真菌检查取混合细胞培养上清液或冻存细胞管样品，依“无菌检查法（通则1101）”进行检查，应符合规定。外源病毒因子检查采用体外培养法检测外源病毒因子。用细胞培养上清液制备活细胞或细胞裂解物作为待检样本，分别接种至少下列三种指示细胞，包括猴源细胞、人二倍体细胞和同种属来源的细胞。对昆虫细胞，还应至少增加两种敏感的指示细胞进行检测。2.细胞检定（至少1~3项）其他检查成瘤性检查、病毒敏感性检查、细胞功能检查、稳定性检查。第四节药品生物检定技术基本操作一、药品生物检定的基本程序1．采样

随机、客观、均匀、合理（还要遵循各检查项目的其他具体要求）。2．样品检验前处理

完整性、有效性。特殊要求（消毒等）。3．样品检验

依规检查。4．检验记录和检验报告

真实、完整、齐全、不随意涂改。二、无菌技术（一）无菌和半无菌环境1．无菌环境是指人们用物理或化学的方法，在某一可控空间内使悬浮粒子、浮游菌、沉降菌等数量达到最低限度，接近于“无菌”的一种空间。环境洁净度B级下局部洁净度A级的单向流空气区域内或隔离系统中即达到《中国药典》2025年版要求的这种“无菌”空间。2．半无菌环境半无菌操作间要求设有紫外灯，在此基础上还应附设空气净化及空调设备，控制室温为20～25℃，达到无菌或半无菌状态。抗生素微生物检定要求的环境是半无菌操作间。（二）实验器材1．灭菌器材

需要灭菌处理的器材均需要灭菌，或采用标注灭菌的产品。如玻璃器皿、接种针、注射器、吸管、试管、培养基、稀释剂等。2．消毒器材

无法灭菌处理的可进行消毒处理。如无菌室的凳子、试管架、天平、工作台面、操作人员双手等。（三）无菌操作方法无菌操作的目的：一是保证待检样品不被环境中的微生物污染；二是防止检样品中的微生物或阳性对照菌等污染环境或感染操作人员。三、消毒与灭菌（一）消毒消毒是指杀灭病原微生物的繁殖体但不能杀死芽孢等全部微生物的过程。消毒的方法一般都是用化学试剂浸泡或擦拭，这些化学试剂称为消毒剂。如75%乙醇溶液、2%碘酒、0.1%苯扎溴铵溶液、3%甲酚皂溶液等。（二）灭菌灭菌是用适当的物理或化学方法将物品中的微生物杀灭或除去的方法。灭菌可杀灭物体中所有的微生物繁殖体及芽孢或孢子，灭菌后的物品不含任何活的微生物。1.干热灭菌法利用热辐射及干热空气进行灭菌的方法。2.湿热灭菌法通过热蒸汽或沸水使细菌蛋白质变性而杀灭微生物的方法（121℃20min或115℃30min）。3.气体灭菌法用化学消毒剂形成的气体杀灭微生物的方法。如环氧乙烷、气态过氧化氢等。4.辐射灭菌法利用放射性同位素放射γ射线（如60Co）、紫外辐射或电离辐射杀灭微生物的方法。5.物理阻留过滤除菌利用微生物不能通过致密、具孔滤材的原理以除去药品中微生物的方法。四、微生物接种技术接种是指将微生物转移到另一个灭菌的新鲜培养基中，使其生长繁殖的过程。为保证接种过程中不受杂菌的污染，接种过程必须采用严格的无菌操作。（一）常用的接种工具

图1-1微生物接种常用的工具（1.接种环2.接种针3.接种钩4.涂布器）（二）常用的接种方法1．斜面接种图1-2斜面划线接种示意图2．穿刺接种图1-3斜面穿刺接种示意图3．平板接种图1-4连续划线接种示意图图1-5分区划线接种示意图4．液体接种

一种是由斜面培养基接入液体培养基，多用于细菌的纯培养，以便进一步鉴定细菌或保存菌种；另一种是由液体培养基接入液体培养基，多用于增菌培养。第五节实验动物操作技术一、常用实验动物及分类（一）实验动物的遗传学分类1．近交系2．远交系3．突变系4．杂交群（二）实验动物的微生物学分类1．普通动物

外观健康，不带有动物烈性传染病和人畜共患病病原。2．清洁动物

除上述普通动物要求，还不应携带对动物危害大和对科学实验干扰大的病原体。3．SPF动物

除上述要求外，还应排除潜在的感染或条件性致病的病原体，以及对实验干扰大的病原体。4．无菌动物、悉生动物

用于特殊的科研实验。二、实验动物操作方法（一）实验动物编号的标记方法1．大鼠、小鼠一般采用颜料涂擦被毛的方法标记。

当数量不超过10只时，可采用单染色法。编号的原则是先左后右，从前到后。如左前腿上为1，左腰部为2，左后腿为3，头部为4，背部为5，尾基部为6，右前腿为7，右腰部为8，右后腿为9。如实验动物编号超过10或更大数字时，可使用双染色法。最常用染色剂是3%~5%苦味酸溶液（黄色）。2．兔、豚鼠常采用的方法有烙印法、染色法、耳孔法。3．犬将号码印在金属牌上。（二）实验动物被毛的去除方法1．剪毛法2．拔毛法3．剃毛法4．脱毛法常用的脱毛剂为8％硫化钠溶液。（三）实验动物的抓取与固定1．小鼠

以掌心包住小鼠背部皮肤，使头、身、尾成一条直线。2．大鼠

可戴帆布手套，左手从背部中央到胸部捏起来抓住，避免提鼠尾。3．豚鼠

参考大鼠。4．兔

一手抓颈背部皮肤，一手托住腰部或臀部，避免提兔耳。也可用盒式固定器。5.犬

避免犬咬伤。（四）实验动物的麻醉方法1．全身麻醉药：乙醚（短效）、戊巴比妥钠（2-4h）2．局部麻醉药：普鲁卡因（30-40min）、丁卡因（60-90min）。（五）实验动物的给药方法1．口服给药：口服灌胃（灌胃针：尖端焊有中空的小圆金属球，防止刺入气管或损伤消化道，针头弯曲20°左右，适应口腔食管等生理弯曲），插入深度一般小鼠3cm、大鼠豚鼠5cm、兔15cm、犬20cm。2．注射给药：皮内注射；皮下注射；腹腔注射；肌内注射；静脉注射（六）实验动物体液及内脏器官的采集方法1.血液采集：大鼠、小鼠尾静脉采血和眼眶静脉丛采血；兔耳缘静脉采血（少量），心脏采血和耳中动脉采血（较大量）。2.消化液采集：胃液、胆汁、胰液等3.尿液采集：代谢笼、压迫膀胱。4.内脏器官采集（七）实验动物的处死方法1.脱颈椎法2.物理和化学药物法

空气栓塞、麻醉法等。谢谢观看第二章

药品生物检定GMP环境监测目录01概述02空气悬浮粒子的监测方法03空气中浮游菌的监测方法04空气中沉降菌的监测方法学习目标1.掌握药品洁净实验室A、B、C、D四级的定义、参数和适用场景。2.掌握环境监测核心项、测试规则、数据计算方法及结果评定标准。3.熟悉“药品微生物实验室质量管理指导原则”、“药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则”，以及测试悬浮粒子、浮游菌、沉降菌的国家标准。知识目标学习目标1.能根据《中国药典》及GMP要求，规划药品微生物实验室的功能分区与洁净区域布局、制定监测方案并执行。2.能正确操作悬浮粒子计数器、浮游菌采样器，完成仪器校准、采样点定位、采样量设定等操作；能按照公式准确计算悬浮粒子的平均浓度、UCL，以及浮游菌/沉降菌的平均菌落数，并依据标准评定监测结果是否合格。3.能根据洁净级别制定对应的环境监测方案，明确监测频次、监测项目及采样点布置；能独立完成表面微生物监测，正确处理采样后的培养皿，并记录完整的监测数据。能力目标学习目标1.深刻认识药品生物检定GMP环境监测对药品无菌性、微生物限度的关键保障作用，树立“药品质量第一”的责任担当。2.秉持“零误差”的严谨态度，在监测操作与数据处理中培养严谨科学的职业素养。3.严格遵守《中国药典》、GMP及国家强制性标准（GB/T系列）的要求，强化合规守法的执业意识。素养目标第一节概述一、药品微生物实验室二、药品洁净实验室药品生物检定中，为保证检验结果的可靠性，必须使用经验证的检测方法并严格按照《中国药典》2025年版通则《9203药品微生物实验室质量管理指导原则》要求进行检验。一、药品微生物实验室

药品微生物实验室质量管理指导原则包括以下几个方面：人员、培养基、试剂、菌种、设施和环境条件、设备、样品、检验方法、污染废弃物处理、结果有效性的保证、实验记录、结果的判断和检测报告、文件等。一、药品微生物实验室一、药品微生物实验室1．实验室的布局和运行

药品微生物检验的实验室应有符合无菌检查法和微生物限度检查要求的、用于开展无菌检查和微生物限度检查及无菌采样等检测活动的、独立设置的洁净室（区）或隔离系统，并配备相应的阳性菌实验室、培养室、试验结果观察区、培养基及试验用具准备（包括灭菌）区、样品接收和贮藏室（区）、标准菌株贮藏室（区）、污染物处理区和文档处理区等辅助区域。应对上述区域明确标识。一、药品微生物实验室1．实验室的布局和运行无菌检查应在隔离器系统或B级背景下的A级单向流洁净区域中进行微生物限度检查应在不低于D级背景下的生物安全柜或B级洁净区域内进行一、药品微生物实验室1．实验室的布局和运行一、药品微生物实验室1．实验室的布局和运行2.环境监测

微生物实验室应按相关国家标准制定完整的洁净室（区）和隔离系统的验证和环境监测标准操作规程，环境监测项目和监测频率及对超标结果的处理应有书面程序。空气悬浮粒子浮游菌沉降菌表面微生物物理参数一、药品微生物实验室3.清洁、消毒和卫生一、药品微生物实验室微生物实验室应有制定清洁、消毒和卫生的标准操作规程A实验室在使用前和使用后应进行消毒，并定期监测消毒效果B所用的消毒剂种类应满足洁净实验室相关要求并定期更换C二、药品洁净实验室药品洁净实验室是指用于药品微生物检验用的洁净区域、隔离系统及其受控环境。二、药品洁净实验室药品洁净实验室的洁净级按空气悬浮粒子大小和数量的不同参考药品生产质量管理规范》（2010年修订）分为A、B、C、D4个级别。1．洁净级别二、药品洁净实验室1．洁净级别高风险操作区，如灌装区、放置胶塞桶和与无菌制剂直接接触的敞口包装容器的区域及无菌装配或连接操作的区域，应当用单向流操作台（罩）维持该区的环境状态。A指无菌配制和灌装等高风险操作A级洁净区所处的背景区域。B指无菌药品生产过程中重要程度较低操作步骤的洁净区。CD二、药品洁净实验室1．洁净级别洁净区各级别空气悬浮粒子的标准规定洁净度级别悬浮粒子最大允许数/立方米静态动态≥0.5μm≥5.0μm≥0.5μm≥5.0μmA级352020352020B级3520293520002900C级3520002900352000029000D级352000029000不作规定不作规定二、药品洁净实验室1．洁净级别洁净区各级微生物监测的动态标准洁净度级别浮游菌cfu/m3沉降菌（f90mm）cfu/4小时表面微生物接触（f55mm）cfu/碟5指手套cfu/手套A级<1<1<1<1B级10555C级1005025－D级20010050－二、药品洁净实验室2．药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则从事药品洁净实验室微生物监测和控制的人员，应具备微生物学或相近专业知识的教育背景，依据所在岗位和职责接受相应的专业技能培训和实验室生物安全方面的培训，经考核合格后方可上岗。二、药品洁净实验室2．药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则参数确认物理参数、空气悬浮粒子和微生物洁净实验室初次使用关键设备发生重大变化二、药品洁净实验室2．药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则各级别洁净环境物理参数建议标准二、药品洁净实验室2．药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则药品洁净实验室监测频次及监测项目

受控区域采样频次监测项目无菌隔离系统

每次实验空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物（含手套）微生物洁净实验室A级每次实验空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物（含手套及操作服）B级每周一次空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物（含手套及操作服）C级每季度一次空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物D级每半年一次空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物第二节空气悬浮粒子的监测方法《中华人民共和国国家标准医药工业洁净室（区）悬浮粒子测试方法》（GB/T16292-2010）依据《中华人民共和国国家标准医药工业洁净室（区）悬浮粒子测试方法》（GB/T16292）、《中华人民共和国国家标准医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法》（GB/T16293）和《中华人民共和国国家标准医药工业洁净室（区）沉降菌测试方法》（GB/T16294）ISO14644-1《洁净间以及相关环境控制第1部分：空气洁净度级别》和JGJ71-90《洁净室施工及验收规范》而制定，基本无动静态之分，洁净级别采用100级、10000级、100000级和300000级进行描述。一、术语和定义二、测试方法三、测试结果四、测试报告一、术语和定义1．洁净室（区）对尘粒及微生物污染规定需进行环境控制的房间或区域。2．局部空气净化仅使室内工作区域或特定的局部空间的空气中含悬浮粒子浓度达到规定的空气洁净度级别的方式。3．单向流沿单一方向呈平行流线并且与气流方向垂直的断面上风速均匀的气流。与水平面垂直的叫垂直单向流，与水平面平行的叫水平单向流。4．非单向流具有多个通路循环特性或气流方向不平行的气流。5．悬浮粒子用于空气洁净度分级的空气悬浮粒子尺寸范围在0.1μm-l000μm的固体和液体粒子。6．洁净度洁净环境内单位体积空气中含大于或等于某一粒径悬浮粒子的统计数量来区分的洁净程度。7．置信上限（95%UCL）从正态分布抽样得到的实际均值按给定的置信度（此处为95%）计算得到的估计上限将大于此实际均值，则称计算得到的这一均值上限为置信上限。8．空态洁净室（区）在净化空气调节系统已安装完毕且完备的情况下，但是没有生产设备、原材料或人员的状态。9．静态静态a：洁净室（区）在净化空气调节系统已安装完毕且完备的情况下，生产工艺设备已安装、洁净室（区）内没有生产人员的状态。静态b：洁净室（区）在生产操作完全结束，生产操作人员撤离现场并经过20min自净后。10．动态洁净室（区）已处于正常生产状态，设备在指定的方式下进行，并且有指定的人员按照规范操作。11．洁净工作台一种工作台或者与之类似的一个封闭围挡工作区。其特点是自身能够供给经过过滤的空气或气体，按气流形式分为垂直单向流工作台、水平单向流工作台等。二、测试方法悬浮粒子的测试采用计数浓度法，即通过测试洁净环境内单位体积空气中含大于或等于某粒径的悬浮粒子数，来评定洁净室（区）的悬浮粒子洁净度级别。1.测试人员洁净室（区）的测试人员应进行包括卫生知识和基本的微生物知识培训并获得相应资格后才能履行对洁净室（区）测试的职责。洁净室（区）的测试人员应该选择与生产操作的空气洁净度级别要求相适应的穿戴方式，外面的衣服不能带进C级以上的区域。2.粒子计数器光散射粒子计数器用于粒径大于或等于0.5μm的悬浮粒子计数，该类型计数利用了空气中的悬浮粒子在光的照射下产生光散射现象，散射光的强度与悬浮粒子的表面积成正比激光粒子计数器用于粒径大于或等于0.1μm的悬浮粒子计数，该类型计数利用了空气中的悬浮粒子在激光束的照射下产生衍射现象，衍射光的强度与悬浮粒子的体积成正比。2.粒子计数器3．测试规则（1）测试条件在测试之前，要对洁净室（区）相关参数进行预先测试。温度在18～26℃，相对湿度在45%～65%。内送风量或风速的测试或压差的测试高效过滤器的泄漏测试。（2）测试状态空态、静态和动态均可进行测试。空态、静态测试时，室内测试人员不得多于2人。（3）测试时间在动态测试时，则须记录生产开始的时间以及测试时间。空态或静态a静态b单向流洁净室（区）净化空气调节系统正常运行时间不少于10min后生产操作人员撤离现场并经过10min后非单向流洁净室（区）净化空气调节系统正常运行时间不少于30min开始测试宜在生产操作人员撤离现场并经过20min自净后（4）采样点数量及其布置在空态或静态测试时，悬浮粒子采样点数目及其布置应力求均匀，并不得少于最少采样点数目。在动态测试时，悬浮粒子采样点数目及其布置应根据产品的生产及工艺关键操作区设置。①最少采样点数目。以下两种方法中任选一种。方法一：按下计算。

式中，NL为最少采样点；A为洁净室或被控洁净区的面积，单位为平方米（m2）。方法二：查下表面积（m2）洁净度级别ABCD<102～3222≥10~<204222≥20~<408222≥40~<10016422≥100~<200401033≥200~<400802066≥400~<1000160401313≥1000~<20004001003232≥20008002006363

②采样点的位置：采样点一般在离地面0.8m高度的水平面上均匀布置。采样点多于5点时，也可以在离地面0.8～1.5m高度的区域内分层布置，但每层不少于5点。平面采样点布置图A级单向流区域、洁净工作台或局部空气净化设施的采样点宜布置在正对气流方向的工作面上，气流图如下：

水平单向流气流形式垂直单向流气流形式（5）采样次数的限定对任何小洁净室（区）或局部空气净化区域，采样点的数目不得少于2个，总采样次数不得少于5次。每个采样点的采样次数可以多于1次，且不同采样点的采样次数可以不同。（6）采样量。不同洁净度级别每次最小的采样量如下：最小采祥量L/次洁净度级别100级10000级100000级300000级≥0.5μm5.662.832.832.83≥5μm8.58.58.58.5（7）采样注意事项对于单向流洁净室（区），粒子计数器的采样管口应正对气流方向；对于非单向流洁净室（区），粒子计数器的采样管口宜向上。布置采样点时，应尽量避开回风口。采样时，测试人员应在采样口的下风侧，并尽量少活动。采样完毕后，宜对粒子计数器进行自净。应采取一切措施防止采样过程的污染。三、测试结果1．结果计算悬浮粒子浓度的采样数据按下述步骤统计计算。（1）采样点的平均悬浮粒子浓度按下式计算。

式中，A为某一采样点的平均粒子浓度，粒/m3；Ci为某一采样点的粒子浓度（i＝1，2，…，n），粒/m3；N为某一采样点上的采样次数，次。（2）洁净室平均粒子浓度按下式计算。

式中，M为平均值的均值，即洁净室（区）的平均粒子浓度，粒/m3；Ai为某一采样点的平均粒子浓度（i＝1，2，…，L），粒/m3；L为采样点数目。（3）标准差按下式计算

式中，SE为平均值均值的标准误差，粒/m3。（4）95%置信上限（UCL）按下式计算，t分布系数的具体数值见下表。

式中，UCL为平均值均值的95%置信上限，粒/m3；t为95%置信上限的t分布系数。采样点数23456789>9t6.312.922.352.132.021.941.901.86－2．结果评定判断悬浮粒子洁净度级别应依据下述两个条件：①每个采样点的平均粒子浓度必须不大于规定的级别界限，即Ai≤级别界限；②全部采样点的粒子浓度平均值均值的95%置信上限必须不大于规定的级别界限，即UCL≤级别界限。

四、测试报告从每一个洁净室（区）得来的测试结果应当被记录，计相一致或不一致的报告也要提交。测试报告应包括以下内容：1．测试者的名称和地址，测试日期2．测试依据3．被测洁净室（区）的平面位置4．悬浮粒子的粒径5．有关测试仪器及其方法的描述6．测试结果第三节空气中浮游菌的监测方法《中华人民共和国国家标准医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法》（GB/T16293-2010）依据第三节空气中浮游菌的监测方法一、术语和定义二、测试方法三、测试结果四、测试报告五、日常监控一、术语和定义1．菌落微生物培养后，由一个或几个微生物繁殖而形成的微生物集落，简称CFU。通常用个数表示。2．浮游菌用标准提及的方法收集悬浮在空气中的活微生物粒子，通过专门的培养基，在适宜的生长条件下繁殖到可见的菌落数。3．浮游菌浓度单位体积空气中含浮游菌菌落数的多少，以计数浓度表示，单位是个/m3或个/L。4．纠偏限度对于受控的洁净室（区），由使用者自行设定微生物含量等级。当检测结果超过该等级时，应启动监测程序对该区域的微生物污染情况立即进行跟踪。5．警戒限度对于受控的洁净室（区），由使用者自行设定一个微生物含量等级，从而给定了一个与正常状态相比最早警戒的偏差值。当超过该最早警戒的偏差值时，应启动保证工艺或环境不受影响的程序及相关措施。二、测试方法浮游菌测试采用的方法是计数浓度法。即通过收集悬游在空气中的生物性粒子于专门的培养基（选择能证实其能够支持微生物生长的培养基），经若干时间和适宜的生长条件让其繁殖到可见的菌落计数，以判定该洁净室的微生物浓度。1.测试人员洁净室（区）的测试人员应进行包括卫生知识和基本的微生物知识培训并获得相应资格后才能履行对洁净室（区）测试的职责。洁净室（区）的测试人员应该选择与生产操作的空气洁净度级别要求相适应的穿戴方式，外面的衣服不能带进C级以上的区域。2．仪器、辅助设备和培养基（1）浮游菌采样器浮游菌采样器用撞击法机理，可分为狭缝式采样器、离心式或针孔式采样器。（2）培养皿一般采用φ90mm×15mm规格的培养皿。可根据所选用采样器选择合适的培养皿。离心式采样器采用专用的同形培养条。（3）培养基大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）或沙氏培养基（SDA）或其他用户认可并经验证了的培养基。（4）恒温培养箱必须定期对恒温培养箱进行校验。3．测试规则（1）测试条件在测试之前，要对洁净室（区）相关参数进行预先测试。温度在18～26℃，相对湿度在45%～65%。内送风量或风速的测试或压差的测试高效过滤器的泄漏测试。（2）测试状态空态、静态和动态均可进行测试。空态、静态测试时，室内测试人员不得多于2人。（3）测试时间在动态测试时，则须记录生产开始的时间以及测试时间。空态或静态a静态b单向流洁净室（区）净化空气调节系统正常运行时间不少于10min后生产操作人员撤离现场并经过10min自净后非单向流洁净室（区）净化空气调节系统正常运行时间不少于30min开始测试宜在生产操作人员撤离现场并经过20min自净后（4）采样点数量及其布置最少采样点数目和采样点的位置可参照“悬浮粒子的检测方法”。工作区测点位置离地0.8m〜1.5m左右（略高于工作面）；送风口测点位置离开送风面30cm左右；可在关键设备或关键工作活动范围处增加测点。（5）最小采样量浮游菌每次最小采样量见下表（6）采样次数

每个采样点一般采样一次。洁净度级别采样量L/次100级100010000级500100000级100300000级100（7）采样注意事项对于单向流洁净室（区）或送风口，采样器采样口朝向应正对气流方向；对于非单向流洁净室(区），采样口向上。布置采样点时，至少应尽量避开尘粒较集中的回风口。采样时，测试人员应站在采样口的下风侧，并尽量少走动。应采取一切措施防止采样过程的污染和其他可能对样本的污染。

培养皿在用于检测时，为避免培养皿运输或搬动过程造成的影响，宜同时进行阴性对照试验，每次或每个区域取1个对照皿，与采样皿同法操作但不需暴露采样，然后与采样后的培养皿（TSA或SDA）一起放入培养箱内培养，结果应无菌落生长。4．采样测试（1）采样测试前仪器、培养皿表面必须严格消毒。采样仪器经消毒后先不放入培养皿，开启浮游菌采样器，使仪器中的残余消毒剂蒸发，时间不少于5min，并检查流量并根据采样量调整设定采样时间。关闭浮游菌采样器，放入培养皿，盖上盖子。置采样口于采样点后，开启浮游菌采样器进行采样。A采样B培养C菌落计数（2）培养全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。采用大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）配制的培养皿经采样后，在30℃~35℃培养箱中培养，时间不少于2d；采用沙氏培养基(SDA)配制配置的培养皿经采样后，在20℃~25℃培养箱中培养，时间不少于5d。每批培养基应有对照试验，检验培养基本身是否污染。可每批选定3只培养皿作对照培养。A采样B培养C菌落计数（3）菌落计数用肉眼对培养皿上所有的菌落直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然用5~10倍放大镜检查，有否遗漏。若平板上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上菌落计数。A采样B培养C菌落计数（4）注意事项使用前应仔细检查每个培养皿的质量，培养基及培养皿有变质、破损或污染的不能使用。对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。由于细菌种类繁多、差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落或培养基沉淀物的区别，必要时用显微镜鉴别宜的生长条件让其繁殖到可见的菌落计数，以判定该洁净室的微生物浓度。三、测试结果1．结果计算用计数方法得出各个培养皿的菌落数，每个测试点的浮游菌平均浓度的计算见下式：

2．结果评定每个测点的浮游菌平均浓度必需低于所选定评定标准中的界限。在静态测试时，若某测点的浮游菌平均浓度超过评定标准，则应重新采样两次，两次测试结果均合格才能判为符合。

四、测试报告测试报告应包括以下内容：1．测试者的名称和地址，测试日期2．测试依据3．被测洁净室（区）的平面位置4．有关测试仪器及其测试方法的描述5．测试结果包括所有统计计算资料。五、日常监控对于浮游菌的监控，宜设定纠偏限度和警戒限度，以保证洁净室（区）的微生物浓度受到控制。应定期检测以检查微生物负荷以及消毒剂的效力，并作倾向分析。静态和动态的监控都可以采用该方法。五、日常监控对于浮游菌的取样频次，如果出现下列情况应考虑修改，在评估以下情况后，也应确定其他项目的检测频次：①连续超过纠偏限度和警戒限度；②停工时间比预计延长；③关键区域内发现有污染存在；④在生产期间，空气净化系统进行任何重大的维修；⑤日常操作记录反映出倾向性的数据；⑥消毒规程的改变；⑦引起生物污染的事故等；⑧当生产设备有重大维修或增加设备时；⑨当洁净室（区）结构或区域分布有重大变动时。第四节空气中沉降菌的监测方法《中华人民共和国国家标准医药工业洁净室（区）沉降菌测试方法》（GB/T16294-2010）依据一、术语和定义二、测试方法三、测试结果四、测试报告五、日常监控一、术语和定义1．沉降菌用本标准提及的方法收集空气中的活微生物粒子，通过专门的培养基，在适宜的生长条件下繁殖到可见的菌落数。2．沉降菌菌落数规定时间内每个平板培养皿收集到空气中沉降菌的数目，以个/皿表示。二、测试方法本测试方法采用沉降法。即通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒子于培养基平皿，经若干时间，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落进行计数，以平板培养皿中的菌落数来判定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净室（区）的洁净度。1.测试人员洁净室（区）的测试人员应进行包括卫生知识和基本的微生物知识培训并获得相应资格后才能履行对洁净室（区）测试的职责。洁净室（区）的测试人员应该选择与生产操作的空气洁净度级别要求相适应的穿戴方式，外面的衣服不能带进C级以上的区域。2．仪器、辅助设备和培养基（1）培养皿一般采用φ90mm×15mm规格的培养皿。（2）培养基大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）或沙氏培养基（SDA）或其他用户认可并经验证了的培养基。（3）恒温培养箱必须定期对恒温培养箱进行校验。3．测试规则（1）测试条件在测试之前，要对洁净室（区）相关参数进行预先测试。温度在18～26℃，相对湿度在45%～65%。内送风量或风速的测试或压差的测试。高效过滤器的泄漏测试。（2）测试状态空态、静态和动态均可进行测试。空态、静态测试时，室内测试人员不得多于2人。（3）测试时间在动态测试时，则须记录生产开始的时间以及测试时间。空态或静态a静态b单向流洁净室（区）净化空气调节系统正常运行时间不少于10min后生产操作人员撤离现场并经过10min自净后非单向流洁净室（区）净化空气调节系统正常运行时间不少于30min开始测试宜在生产操作人员撤离现场并经过20min自净后（4）采样点数量及其布置最少采样点数目和采样点的位置可参照“悬浮粒子的检测方法”。工作区测点位置离地0.8m~1.5m左右（略高于工作面）；送风口测点位置离开送风面30cm左右；可在关键设备或关键工作活动范围处增加测点。（5）最少培养皿数

在满足最少采样点数目的同时，还宜满足最少培养皿数，见下表。（6）采样次数

每个采样点一般采样一次。洁净度级别最少培养皿数（φ90mm）100级1410000级2100000级2300000级2（7）采样注意事项

对于单向流洁净室（区）或送风口，采样器采样口朝向应正对气流方向；对于非单向流洁净室(区），采样口向上。布置采样点时，至少应尽量避开尘粒较集中的回风口。

采样时，测试人员应站在采样口的下风侧，并尽量少走动。应采取一切措施防止采样过程的污染和其他可能对样本的污染。（7）采样注意事项

培养皿在用于检测时，为避免培养皿运输或搬动过程造成的影响，宜同时进行阴性对照试验，每次或每个区域取1个对照皿，与采样皿同法操作但不需暴露采样，然后与采样后的培养皿（TSA或SDA）一起放入培养箱内培养，结果应无菌落生长。4．采样测试（1）采样

测试前培养基表面必须严格消毒。将已制备好的培养皿按采样点布置图逐个放置，然后从里到外逐个打开培养皿盖，使培养基表面暴露在空气中。静态测试时，培养皿暴露时间为30min以上；动态测试时，培养皿暴露时间为不大于4h。A采样B培养C菌落计数（2）培养

全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。采用大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）配制的培养皿经采样后，在30℃~35℃培养箱中培养，时间不少于2d；采用沙氏培养基(SDA)配制配置的培养皿经采样后，在20℃~25℃培养箱中培养，时间不少于5d。每批培养基应有对照试验，检验培养基本身是否污染。可每批选定3只培养皿作对照培养。A采样B培养C菌落计数（3）菌落计数。用肉眼对培养皿上所有的菌落直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然用5~10倍放大镜检查，有否遗漏。若平板上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上菌落计数。A采样B培养C菌落计数（4）注意事项

测试用具要作灭菌处理，以确保测试的可靠性、正确性。采取一切措施防止人为对样本的污染。

对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀物的区别，必要时用显微镜鉴别。采样前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的应剔除。三、测试结果1．结果计算用计数方法得出各个培养皿的菌落数，然后按下式计算平均菌落数。式中，是平均菌落数，M1为1号培养皿菌落数；M2为2号培养皿菌落数，Mn为n号培养菌落数；n为培养皿总数。2．结果评定用平均菌落数判断洁净室（区）空气中的微生物。每个测试点的平均菌落数必须低于所选定的评定标准。在静态测试时，若某测试点的沉降菌平均菌落数超过评定标准，则应重新采样两次，两次测试结果均合格才能判定为合格。

四、测试报告测试报告应包括以下内容：1．测试者的名称和地址，测试日期2．测试依据3．被测洁净室（区）的平面位置4．有关测试仪器及其测试方法的描述5．测试结果包括所有统计计算资料。五、日常监控对于沉降菌的监控，宜设定纠偏限度和警戒限度，以保证洁净室（区）的微生物浓度受到控制。应定期检测以检查微生物负荷以及消毒剂的效力，并作倾向分析。静态和动态的监控都可以采用该方法。对于沉降菌的取样频次，如果出现下列情况应考虑修改，在评估以下情况后，也应确定其他项目的检测频次：①连续超过纠偏限度和警戒限度；②停工时间比预计延长；③关键区域内发现有污染存在；④在生产期间，空气净化系统进行任何重大的维修；⑤日常操作记录反映出倾向性的数据；⑥消毒规程的改变；⑦引起生物污染的事故等；⑧当生产设备有重大维修或增加设备时；⑨当洁净室（区）结构或区域分布有重大变动时。谢谢观看第三章无菌检查法目录01概述02无菌检查法的基本步骤学习目标1.掌握无菌检查法的原理和操作流程。2.熟悉无菌检查法使用的培养基、菌种等。3.明确无菌检查在无菌制剂质量控制中的意义。知识目标1.能根据质量标准独立完成药品的无菌检查。2.熟练、规范进行无菌检查的抽样、取样。3.正确判断无菌检查的结果。能力目标1.树立无菌操作的意识。2.逐步养成规范、严谨、细致的实验操作习惯。素养目标案例分析——“欣弗”事件事发：2006年7月24日，青海省西宁市部分患者使用上海华源股份有限公司安徽华源生物药业有限公司（以下简称“安徽华源”）生产的克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液（即“欣弗”注射液）后，出现胸闷、心悸、心慌、寒战、腹泻、恶心、呕吐、过敏性休克等临床症状。随后，黑龙江、广西、浙江、山东等省区也分别报告发现类似病例。全国16个省区共报告“欣弗”病例93例，死亡11人。案例分析——“欣弗”事件原因：8月15日，国家食品药品监督管理局通报了“欣弗”事件的调查结果。导致这起不良事件的主要原因是，安徽华源2006年6月至7月生产的“欣弗”注射液未按批准的工艺参数灭菌，降低灭菌温度、缩短灭菌时间、增加灭菌柜装载量（该药品按规定应经过105℃、30分钟的灭菌过程。但安徽华源擅自将灭菌温度降到100℃至104℃不等，将灭菌时间缩短到1到4分钟不等），影响了灭菌效果。经中国药品生物制品检定所对相关样品进行检验，结果表明无菌检查和热原检查不符合规定。案例分析——“欣弗”事件反思：

药品作为一种特殊的商品，药品的质量安全直接关系到人们的健康和生命，必须做到100%合格。议一议什么是无菌检查？为什么注射液要进行无菌检查？第一节概述无菌检查法：

系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器械、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。无菌检查用薄膜过滤器一、无菌检查法的基本原理及意义无菌检查是利用无菌操作的方法，将被检查的药品分别加入适合需氧菌、厌氧菌和真菌生长的液体培养基中，置于适宜温度下培养一定时间后，观察有无微生物生长，以判断药品是否合格。当供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染，也就是无菌试验并不能用于保证整批产品的无菌性，但是它可用于确定批产品不符合无菌要求。无菌检查方法薄膜过滤法适用于有抗菌作用或大容量的供试品直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行检查的供试品二、无菌检查法的环境要求无菌检查应在B级背景下的A级单向流洁净区域中进行。检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供拭品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及受控环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验需对试验环境进行监测。三、无菌检查法的适用范围无菌检查注射剂眼用制剂部分外用制剂吸入液体制剂可吸收的止血剂生物制品原液或半成品临床必需无菌的医疗器械体外用诊断制品半成品要求无菌的原料药第二节无菌检查法的基本步骤（一）抽样原则抽样时尽量抽取批生产开始、结束或生产过程出现异常情况下的产品进行检验，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的样品。应采用随机抽样的原则进行无菌检查时的抽样。一、供试品抽样（二）检验数量和检验量检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量，成品每亚批均应进行无菌检查。检验量是指供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两种培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基。采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允许，应将所有容易内的内容物全部过滤。1.出厂产品及生物制品的原液和半成品最少检验数量供试品批产量N（个）接种每种培养基的最少检验数量注射剂≤10010%或4个（取较多者）100＜N≤50010个＞5002%或20个（取较少者）20个（生物制品）大体积注射剂（＞100ml）2%或10个（取较少者）20个（生物制品）冻干血液制品＞5ml每柜冻干≤2005个每柜冻干＞20010个冻干血液制品≤5ml≤1005个100＜N≤50010个＞50020个供试品批产量N（个）接种每种培养基的最小检验数量眼用及其他非注射产品（单剂量包装的产品，按照注射剂供试品要求确定最小检验数量）≤2005%或2个（取较多者）＞20010个桶装无菌固体原料≤4每个容器4＜N≤5020%或4个容器（取较多者）＞502%或10个容器（取较多者）抗生素固体原料药（≥5g）6个容器生物制品原液或半成品每个容器（每个容器制品的取样量为总量的0.1%或不少于10ml，每开瓶一次，应如上法）体外用诊断制品半成品每批（抽样量应不少于3ml）医疗器械≤10010%或4件（取较多者）100＜N≤50010件＞5002%或20件（取较少者）2.上市抽验样品的最少检验数量供试品批产量N（个）液体制剂10固体制剂10血液制品V＜50mlV≥50ml62医疗器械103.供试品的最少检验量供试品批产量N（个）接种每种培养基的最小检验数量液体制剂≤1ml全量1ml＜V≤40ml半量，但不少于1ml40ml＜V≤100ml20mlV＞100ml10%但不少于20ml＞50020个抗生素液体制剂1ml需混悬或乳化的不溶性制剂、乳膏剂和软膏剂取每支供试品，总量合计不少于200mg固体制剂M＜50mg全量50mg≤M＜300mg半量，但不得少于50mg300mg≤M＜5g150mgM≥5g500g半量（生物制品）供试品批产量N（个）接种每种培养基的最小检验数量生物制品的原液及半成品半量医疗器械外科用敷料棉花及纱布取100mg或1cm×3cm缝合线、一次性医用材料整个材料带导管的一次性医疗器具（如输液袋）二分之一内表面积其他医疗器械整个器具（切碎或拆散开）二、操作过程（一）培养基

培养基是微生物生长的基础，根据无菌检查的原理，一种培养基很难满足所有菌的生长要求，所以无菌检查用培养基包括硫乙醇酸盐流体培养基（用于厌氧菌的培养，也可用于需氧菌的培养）和胰酪大豆胨液体培养基（用于真菌和需氧菌的培养）。1.培养基的制备

培养基可按处方配制，也可用市售按该处方生产的符合规定的脱水培养基或商品化的预制培养基代替。使用脱水培养基时，按照使用说明书进行配制，配制培养基时称量要迅速，以免吸潮而影响称量的准确性。培养基配制好后，应澄清、无沉淀，并应采用验证合格的灭菌程序灭菌。2.培养基的保存

制备好的培养基若不即时使用，应放置于无菌密闭的容器中，在2～25℃、避光条件下保存，并在经验证的保存期内使用。培养基的配制器材的包扎培养基灭菌3.培养基的适用性检查目的：无菌检查用培养基的合格与否直接影响到试验结果的准确性与可靠性，因此在无菌检查正式进行前或在检测供试品的同时，应进行培养基的适用性检查，以确保无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。方法：无菌性检查和灵敏度检查。（1）无菌性检查：要求每批培养基随机抽取不少于5支（瓶），细菌培养基置于30～35℃培养14天，真菌培养基置于20～25℃培养14天，应均无菌生长。如有菌生产则应废弃，需重新配置。（2）灵敏度检查：培养基灵敏度检查是用已知的标准菌种来鉴定培养基的敏感度（6种），根据加入定量规定菌种的生长情况判定培养基灵敏度是否符合无菌检查的要求。加菌对照管均应生长良好。金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）铜绿假单胞菌（革兰氏阴性菌）枯草芽孢杆菌（芽孢杆菌）生孢梭菌（厌氧菌）白色念珠菌（酵母菌）黑曲霉菌（霉菌）（二）稀释液、冲洗液制备方法0.1%无菌蛋白胨水溶液取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，必要时滤过使澄清，调节pH值至7.1±0.2，分装，灭菌。2.pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾3.56g，无水磷酸氢二钠5.77g，氯化钠4.30g，蛋白胨1.00g，加水1000ml，微温溶解，必要时滤过使澄清，分装，灭菌。（三）方法验证试验

在确定产品的无菌检测试验方法时，或建立新的检测方法时，以及试验条件发生更改时，都必须对新的或更改后的方法加以验证，以确定供试品在该试验条件下有无抑菌活性，验证试验条件是否符合要求，保证该试验条件下检测结果的准确有效。菌种金黄色葡萄球菌〔CMCC(B)26003〕枯草芽孢杆菌〔CMCC（B）63501〕生孢梭菌〔CMCC(B)64941〕白色念珠菌〔CMCC(F)98001〕黑曲霉〔CMCC(F)98003〕大肠埃希菌〔CMCC(B)44102〕1.菌种及菌液的制备注：对大肠埃希菌敏感的抗生素类产品宜选用大肠埃希菌代替铜绿假单胞菌2.验证方法（1）直接接种法

培养基准备：取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基6管，分别接入不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各2管；取符合直接接种法培养基用量要求的胰酪大豆胨液体培养基6管，分别接入不大于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。

供试品管、对照管：上述两管培养基中1管按供试品的无菌检查要求，接入每支培养基规定的供试品接种量，另1管作为对照，置规定的温度培养，培养时间不得超过3～5天。供试品管对照管另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。按供试品的无菌检查要求，取每种培养基规定接种的供试品总量薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入不大于100cfu的试验菌，过滤。加培养基至滤筒内硫乙醇酸盐流体培养基金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌胰酪大豆胨液体培养基枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌（2）薄膜过滤法置规定温度培养，培养时间不得超过5天。3.结果判断将供试品管与对照管相比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用。4.消除抑菌作用的方法（1）可增加滤膜的冲洗量，但每片滤膜的总量不宜过大，以免影响滤膜上微生物的生长情况。（2）使用相对应的中和剂，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。（3）有些供试品有抑菌作用或含有抑菌物质而又没有适当的中和剂，可加大培养基的使用量，将供试品稀释至不具抑菌作用的浓度即可。（四）阳性对照和阴性对照

1.阳性对照阳性对照试验是检查阳性对照菌在加入供试品的培养基中能否生长，以验证供试品有无抑菌活性物质和试验条件是否符合要求的试验。阳性对照菌的生长证明无菌检查试验所使用的技术条件恰当，否则试验无效。根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。阳性对照试验的菌液制备与方法适用性试验相同，加菌量不大于100cfu，供试品用量与供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量相同，对照管培养不超过5天，应生长良好。2.

阴性对照

供试品无菌检查时，取相应稀释液和溶剂、冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。（五）供试品的无菌检查供试品的无菌检查分为薄膜过滤法和直接接种法。前者适用于任何类型药品的无菌检查，后者适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品。操作时，应先用适宜的方法对供试品容器表面进行彻底消毒，如果供试品容器内有一定的真空度，可以用适宜的无菌器材（如带有除菌过滤器的针头）向容器内导入无菌空气，再按无菌操作启开容器取出内容物。1.薄膜过滤法薄膜过滤法是各国药典和《中国药典》规定的无菌检测的方法，适用于任何类型药品的无菌检查，具有适用性广、准确性高的特点。薄膜过滤器（1）原理

供试品通过集菌仪的定向蠕动加压作用，实施正压过滤并在滤器内进行培养，用以检测供试品是否无菌。供试品通过进样管连续被注入集菌培养器中，利用集菌培养器内形成的正压，通过0.2μm或0.45μm孔径的滤膜过滤，供试品中可能存在的微生物被截留收集在滤膜上，通过冲洗滤膜除去抑菌成分。然后把所需培养基通过进样管直接注入集菌培养器中，放置于规定的温度下培养，观察是否有菌生长。（2）薄膜过滤器

薄膜过滤法一般应采用封闭式薄膜过滤器。它是由一个具有蠕动泵头的集菌仪和一套具有3个或2个培养瓶的一次性使用的全封闭集菌培养器构成的过滤系统。将一次性集菌培养器（依供试品种类选择适宜的集菌培养器）放置于集菌仪的架上，而塑胶软导管放置于集菌仪的蠕动泵的管槽内，其进液管的双芯针头插入供试液或冲洗液等容器的塞上。（3）基本操作

无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45μm，滤膜直径约为50mm，若使用其他尺寸的滤膜，应对稀释液和冲洗液体积进行调整，并重新验证。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。薄膜过滤法检测供试品时，应根据不同供试品采用不同的处理方法。例如，水溶性供试品可取规定量直接过滤或混合至含不少于100ml适宜稀释液的无菌容器中，混匀过滤。（4）培养及观察

将接种供试品后的培养基容器分别按各培养基规定的温度培养不少于14天；接种生物制品的硫乙醇酸盐流体培养基的容器应分成两等份，一份置30~35℃培养，一份置20~25℃培养。

培养期间应定期观察并记录是否有菌生长。

如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液不少于1ml转种至同种新鲜培养基中，将原始培养物和新接种的培养基继续培养不少于4天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。2.直接接种法

相对于薄膜过滤法，直接接种法具有操作简便、所需仪器设备少，适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品。（1）供试品的接种：取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中。除生物制品外，一般样品无菌检查时两种培养基接种的支/瓶数相等；生物制品无菌检查时硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基接种的支/瓶数为2:1。除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，胰酪大豆胨液体培养基每管装量不少于10ml。

不同类型供试品应采用不同方法处理。如固体供试品，应取规定量，直接等量接种至各管培养基中，或加入适宜溶剂溶解，或按说明复溶后再接种。非水溶性供试品可加入适量的聚山梨酯80或其他适宜的乳化剂/稀释剂使其乳化再接种。（2）培养及观察

与薄膜过滤法相同。

接种供试品后的培养基容器分别按各培养基规定的温度培养不少于14天。三、结果判断试验结果有效的前提是阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。只有符合下列至少一个条件时方可判试验结果无效：（1）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求；（2）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素；（3）在阴性对照中观察到微生物生长；（4）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。谢谢观看！第四章微生物限度检查法目录01概述02微生物计数检查03控制菌检查04中药饮片微生物限度检查法05洋葱伯克霍尔德菌群检查法学习目标1.掌握微生物限度检查法的概念、检查项目、检查方法、限度及结果判断。2.熟悉微生物计数检查、控制菌检查、洋葱伯克霍尔德菌群检查的流程。3.了解微生物限度检查对人员环境与操作的要求、微生物限度检查的意义、检查方法的验证及培养基的适用性检查等内容。知识目标1.能根据药品质量标准独立完成不同类型制剂的微生物计数检查、代表性控制菌（大肠埃希菌、金黄色葡萄糖球菌）的检查。2.熟练、规范进行微生物限度检查的抽样、取样。3.正确判断微生物限度检查的结果。能力目标1.明确非无菌制剂的安全性检查的重要意义。2.逐步养成规范、严谨、细致的微生物相关试验操作习惯，特别是检查用菌种的使用。素养目标第一节概述微生物限度检查法是检查《中国药典》规定的非无菌制剂及其药用原料、辅料和中药提取物、中药饮片受微生物污染程度的一种方法。除另有规定外，活菌制剂不适用本法。1.保证药品质量2.评价药品生产过程的卫生状况一、微生物限度检查法的概念及意义1.微生物计数检查系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数，包括需氧菌总数计数、霉菌和酵母菌总数计数。2.控制菌检查包括耐胆盐革兰阴性菌、大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌及白色念珠菌的检查。二、微生物限度检查内容及要求《中国药典》2025年版规定微生物限度检查应在环境洁净度为不低于D级背景下的生物安全柜或B级洁净区域内进行。检验过程必须严格遵守无菌操作。环境监测按照现行版医药工业洁净室（区）国家标准验证。三、微生物限度检查对环境和设备的要求四、微生物限度标准给药途径需氧菌总（cfu/g、cfu/ml或cfu/10cm2）霉菌和酵母菌总数（cfu/g、cfu/ml或cfu/10cm2）控制菌口服给药①固体制剂液体及半固体制剂

103102

102101不得检出大肠埃希菌（1g或1ml）；含脏器提取物的制剂还不得检出沙门菌（10g或10ml）口腔黏膜给药制剂齿龈给药制剂鼻用制剂

102

101不得检出大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g、1ml或10cm2）耳用制剂皮肤给药制剂102101不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g、1ml或10cm2）呼吸道吸入给药制剂102101不得检出大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、耐胆盐革兰阴性菌（1g或1ml）阴道给药制剂尿道给药制剂102101不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌；中药制剂还不得检出梭菌（1g、1ml或10cm2）直肠给药

103

102其他局部给药制剂102101不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g、1ml或10cm2）表4-1非无菌化学药品制剂、生物制品制剂、不含药材原粉的中药制剂微生物限度标准给药途径需氧菌总（cfu/g、cfu/ml或cfu/10cm2）霉菌和酵母菌总数（cfu/g、cfu/ml或cfu/10cm2）控制菌固体口服给药制剂不含豆豉、神曲等发酵原粉

含豆豉、神曲等发酵原粉

104（丸剂为3×104）105

102

5×102不得检出大肠埃希菌（1g）；不得检出沙门菌（10g）；耐胆盐革兰阴性菌应小于102cfu（1g）液体及半固体口服给药制剂不含豆豉、神曲等发酵原粉含豆豉、神曲等发酵原粉

5×102103

102102不得检出大肠埃希菌（1g或1ml）；不得检出沙门菌（10g或10ml）；耐胆盐革兰阴性菌应小于102cfu（1g或1ml）固体局部给药制剂用于表皮或黏膜不完整用于表皮或黏膜完整

103104

102102不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g或10cm2）；阴道、尿道给药制剂还不得检出白色念珠菌、梭菌（1g或10cm2）液体及半固体局部给药制剂

102

102不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g或1ml）；阴道、尿道给药制剂还不得检出白色念珠菌、梭菌（1g或1ml）表4-2非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准需氧菌总（cfu/g、cfu/ml或cfu/10cm2）霉菌和酵母菌总数（cfu/g、cfu/ml或cfu/10cm2）控制菌103102未作统一规定表4-3非无菌药用原料及辅料微生物限度标准给药途径需氧菌总（cfu/g、cfu/ml或cfu/10cm2）霉菌和酵母菌总数（cfu/g、cfu/ml或cfu/10cm2）控制菌中药提取物103102未作统一规定直接口服及泡服饮片105103不得检出大肠埃希菌（1g或1ml）；不得检出沙门菌（10g或10ml）；耐胆盐革兰阴性菌应小于104cfu（1g或1ml）表4-4中药提取物及中药饮片微生物限度标准除中药饮片外，非无菌药品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数标准：（1）101cfu：可接受的最大菌数为20；（2）102cfu：可接受的最大菌数为200；（3）103cfu：可接受的最大菌数为2000；（4）3×103cfu：可接受的最大菌数为6000，依此类推。中药饮片的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数标准：（1）101cfu：可接受的最大菌数为50；（2）102cfu：可接受的最大菌数为500；（3）103cfu：可接受的最大菌数为5000；

（4）104cfu：可接受的最大菌数为50000，依此类推。第二节微生物计数检查（一）取样1．检验量检验量即一次试验所用的