ISO 249142026 食物链微生物学 用于检测微生物和相关遗传标记的环介导等温扩增(LAMP) 一般要求和定义标准立项发展报告

食物链微生物学用于检测微生物和相关遗传标记的环介导等温扩增（LAMP）一般要求和定义标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:Microbiologyofthefoodchain—Loop-mediatedisothermalamplification(LAMP)forthedetectionofmicroorganismsandassociatedgeneticmarkers—Generalrequirementsanddefinitions摘要随着全球食品安全形势日趋复杂，快速、灵敏、特异的微生物检测技术已成为保障食物链安全的关键支撑。环介导等温扩增（Loop-mediatedIsothermalAmplification,LAMP）技术以其恒温扩增、高特异性、操作简便等优势，在国际食品微生物检测领域受到日益广泛的关注和应用。然而，该技术在食品检验领域的应用长期缺乏统一的国际标准规范，导致不同实验室间检测结果的可比性和互认性不足，制约了其在食品安全监管和国际贸易中的推广应用。在此背景下，国际标准化组织（ISO）正式发布ISO24914:2026《食物链微生物学用于检测微生物和相关遗传标记的环介导等温扩增（LAMP）一般要求和定义》。该标准首次在国际层面系统界定了LAMP技术在食物链微生物检测中的术语体系、通用要求、质量控制准则和方法验证框架，填补了食品微生物分子检测领域国际标准的空白，对于促进LAMP技术的规范化应用、提升食品安全检测能力的国际互认水平具有里程碑意义。本报告对该标准的立项背景、研制过程、核心技术内容和推广应用前景进行系统阐述，以期为标准实施和相关技术发展提供参考。关键词：食物链微生物学；环介导等温扩增；LAMP；国际标准；ISO24914；食品安全；微生物检测Keywords:Foodchainmicrobiology;Loop-mediatedisothermalamplification;LAMP;Internationalstandard;ISO24914;Foodsafety;Microbiologicaldetection一、引言食品安全是全球公共卫生领域面临的重大挑战。据世界卫生组织（WHO）统计，全球每年约有6亿人因食用受污染的食品而患病，其中约42万人死亡。微生物污染是导致食源性疾病的首要因素，沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠杆菌O157:H7、副溶血性弧菌等食源性致病菌的快速、准确检测，直接关系着食品安全的有效保障和国际贸易的顺利进行。传统微生物检测方法主要依赖培养分离和生化鉴定，虽然结果可靠、成本相对较低，但检测周期长（通常需3—7天）、操作繁琐、对活菌状态有严格要求，难以满足现代食品工业对快速检测和源头管控的需求。聚合酶链式反应（PCR）及其衍生技术虽然大幅缩短了检测时间并提高了灵敏度，但对实验仪器和操作环境要求较高，需要精密的温度循环设备和专业技术人员，在一定程度上限制了其在基层实验室和现场快速检测中的应用推广。环介导等温扩增技术由日本荣研化学株式会社的Notomi博士等人于2000年首次报道，其核心原理是利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶和针对靶序列六个特定区域设计的四至六条引物，在恒温条件（60—65℃）下实现靶核酸的高效、特异性扩增。与传统PCR相比，LAMP技术具有以下显著优势：其一，等温反应无需精密温控设备，仅需普通水浴锅或恒温加热块即可完成，大大降低了设备门槛；其二，该技术特异性极高，由于要求引物同时识别靶序列的六个独立区域，非特异性扩增的概率极低；其三，扩增效率极高，通常在15—60分钟内即可完成检测，且产物可直接通过浊度变化、荧光信号或目视比色进行判读；其四，对样品中PCR抑制物的耐受性较强，可在一定程度上简化前处理流程。基于上述优势，LAMP技术已被广泛应用于病原微生物检测、转基因成分鉴定、动植物疫病诊断等多个领域。然而，LAMP技术在国际标准化层面长期存在制度性空白。尽管国际标准化组织食品委员会（ISO/TC34）已就食品微生物检测的诸多分子生物学方法制定了系列标准（如ISO22174、ISO20837、ISO20838等涉及PCR技术的系列标准），但针对LAMP技术的通用要求和定义始终未形成统一的国际规范。这一标准化缺位导致了各实验室在引物设计、反应条件优化、结果判读标准、质量控制措施等方面各自为政，检测结果的准确性和可比性无法得到有效保障。随着LAMP技术在食品安全检测领域应用范围不断拓展，国际社会对制定统一的LAMP检测技术标准的呼声日益高涨。二、标准立项背景与研制过程（一）立项背景与必要性分析1.技术应用的快速普及与标准缺位之间的矛盾近年来，随着LAMP技术的不断成熟和商业化检测试剂的陆续面世，该技术在食品微生物检测中的应用呈现快速增长态势。在欧盟、日本、美国以及包括中国在内的多个国家，LAMP技术已被用于沙门氏菌、弯曲杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌等重要食源性致病菌的快速筛查。然而，由于缺乏统一的国际标准，不同制造商生产的LAMP检测试剂在引物设计、反应体系、判读标准等方面存在显著差异。一项针对LAMP检测文献的系统综述表明，不同研究团队报道的LAMP检测灵敏度和特异性差异较大，部分原因可归因于方法标准化程度不足。这种差异不仅影响检测结果的可靠性，也阻碍了不同实验室间检测数据的互认与比较。2.国际贸易发展对技术标准互认的迫切需求食品国际贸易的快速发展对检测标准的国际互认提出了更高要求。世界贸易组织《技术性贸易壁垒协定》（TBT协定）明确要求各成员方以国际标准作为技术法规和合格评定程序的基础，以避免不必要的贸易壁垒。在食品微生物检测领域，国际食品法典委员会（CAC）和相关国际标准化文件共同构成了食品贸易中微生物检测方法互认的制度框架。ISO24914作为针对LAMP技术的首个国际标准，将为各国采纳和认可LAMP检测结果提供统一的制度依据，有助于减少因检测方法差异引发的贸易纠纷。3.食品安全监管模式变革的技术支撑需求当前，国际食品安全监管理念正从终端产品检验向全过程风险管控转变。食品生产加工企业需要在生产环节对原料、半成品和成品进行快速、频繁的微生物监测，而传统的培养检测方法由于周期过长，难以满足在线监测和及时决策的需求。LAMP技术因其快速、简便的突出优势，在食品生产企业内部质量控制和食品安全管理体系的实施中具有广阔的应用前景。制定统一的国际标准将有助于规范企业在内部检测中的方法选择和质量控制，提升食品行业整体微生物风险管控水平。（二）标准研制过程ISO24914:2026由国际标准化组织食品委员会（ISO/TC34）下属的食品微生物学分技术委员会（SC9）负责制定。该标准的研制遵循ISO/IEC导则规定的标准制定程序，经历了以下主要阶段：1.提案阶段（NP）：在前期充分调研和技术论证的基础上，由相关成员国提出新工作项目提案，经ISO/TC34/SC9投票表决通过后正式立项。2.工作组草案阶段（WD）：分技术委员会成立了专门工作组，由来自各国标准化机构、食品微生物学实验室、学术研究机构及产业界的专家共同参与起草工作。工作组对LAMP技术的原理、应用范围、关键操作步骤和质量控制要素进行了系统梳理，形成了工作组草案。3.委员会草案阶段（CD）：工作组草案经多次修改完善后提交分技术委员会审议，各成员体对草案文本进行技术审查和评议，提出修改意见。起草工作组根据反馈意见对草案进行了多轮修订。4.国际标准草案阶段（DIS）：经分技术委员会审议通过后，形成国际标准草案（DIS）并分发至ISO各成员体进行投票和征求意见。该阶段广泛征集了各国在技术内容、标准适用性、与现行标准协调性等方面的意见。5.最终国际标准草案阶段（FDIS）：根据DIS阶段的投票和意见反馈，对标准文本进行最终修订后形成最终国际标准草案，经全体成员体投票通过后，于2026年1月13日正式发布。该标准的研制周期充分体现了国际标准制定的严谨性和广泛协商性，确保了标准内容在技术先进性、实用性和全球适用性之间的平衡。三、标准主要内容与技术要点ISO24914:2026《食物链微生物学用于检测微生物和相关遗传标记的环介导等温扩增（LAMP）一般要求和定义》系统规定了LAMP技术在食物链微生物检测中应用的通用性技术要求和规范性定义。标准的核心内容涵盖以下几个主要方面：（一）范围界定标准明确规定了用于检测食物链中微生物及其相关遗传标记的LAMP方法的一般要求，包括对扩增靶序列（DNA或RNA）、扩增产物（扩增子）的检测要求，以及方法开发、验证和实施中的通用规范。该标准适用于食品、饲料、食品生产环境样品以及初级生产阶段的微生物检测，为实验室开展LAMP检测提供了统一的技术基准。在适用范围上，标准兼顾了不同实验室条件和技术水平的差异。对于具备分子生物学检测能力的专业实验室，标准提供了全面的技术要求和质量控制指南；对于拟采用LAMP技术进行现场快速检测或基层筛查的应用场景，标准也给出了相应的适用性规定。同时，标准明确指出其不涉及具体的致病菌或特定食品类别的检测方案，具体应用应由各专业领域标准或实验室内部方法予以补充规定，体现了框架性标准与专用标准之间的合理衔接。（二）规范性引用文件标准在规范性引用文件中纳入了GB/T6682（分析实验室用水规格和试验方法）和GB/T27423（实验室质量控制利用统计质量保证和控制图技术评价检测测量系统的性能）等基础性标准。需要说明的是，因本报告面向中文使用者，此处参照我国国家标准对ISO相应文件的等同采用情况予以标注。这些引用文件确保了LAMP检测过程中实验用水质量、实验室质量控制等方面与国际通行要求保持一致，为LAMP检测结果的准确性和可追溯性提供了基础性保障。（三）术语和定义标准对LAMP技术相关的核心术语进行了系统界定，建立了统一的术语体系。主要包括：1.LAMP（环介导等温扩增）：一种在恒温条件下利用具有链置换活性的DNA聚合酶和多条特异性引物，对靶核酸序列进行高效等温扩增的技术方法。该定义明确了LAMP技术的核心特征——恒温反应和链置换扩增机制。2.扩增子（Amplicon）：指通过LAMP反应产生的特定靶序列的扩增产物，是LAMP检测结果判读的直接对象。3.靶序列（Targetsequence）：指待检测微生物基因组中特定的核酸序列区域，该序列的特异性决定了LAMP检测的特异性。4.引物（Primer）：指与靶序列特定区域互补的寡核苷酸片段，包括内引物（FIP/BIP）和外引物（F3/B3），必要时还包括环引物（Loopprimer）。标准对各类引物的设计原则和功能定位进行了规范。5.内引物（FIP/BIP）：具有两个独立结合区域的特殊引物，是LAMP反应中实现靶序列环状扩增的关键引物。6.检测限（Limitofdetection,LOD）：在规定的检测条件下，能够以一定置信水平检测到的靶标的最低浓度或数量。标准要求实验室在方法验证和应用中明确测定并声明LOD。7.阴性对照（Negativecontrol）：不含靶核酸但与其他样品经历相同处理过程的对照样品，用于监测实验过程中可能出现的污染情况。8.阳性对照（Positivecontrol）：含有已知浓度靶核酸的对照样品，用于验证LAMP反应体系和操作流程的有效性。9.扩增抑制物（Amplificationinhibitor）：存在于样品基质中可能抑制LAMP反应正常进行的物质，如多糖、蛋白质、脂类及某些化学添加剂等。10.遗传标记（Geneticmarker）：可用于区分或鉴定特定微生物的核酸序列特征。上述术语的确立为LAMP技术在食品微生物检测领域的使用提供了统一的语言基础，消除了因术语使用不一致导致的歧义和理解偏差。（四）LAMP技术原理与方法概述标准对LAMP技术的基本原理进行了规范性描述。LAMP反应基于具有链置换活性的BstDNA聚合酶，在恒定温度（通常为60—65℃）条件下，通过四条（或六条）特异性引物对靶序列的六个（或八个）独立区域进行识别和扩增。反应初始阶段，内引物FIP的F2区与靶序列的F2c区结合并启动链合成，外引物F3随后结合至F3c区并延伸，通过链置换作用释放出单链产物；该单链产物在两端形成环状结构后，继续作为模板进行后续的循环扩增。反应最终产生由多个反向重复序列组成的茎环结构DNA混合物（即扩增子），可通过多种方式进行检测。与PCR技术相比，LAMP在引物设计要求（识别6—8个靶序列区域）、反应条件（恒温vs.变温）、产物结构（茎环DNA混合物vs.特异性长度的双链DNA）、检测方式（浊度/荧光/目视vs.电泳/荧光探针）等方面存在显著差异。标准在描述LAMP原理时注意了与ISO22174（PCR通用要求和定义）等技术标准的术语和技术内容的协调一致，使用者可参照上述标准了解不同分子扩增技术的异同。（五）通用要求与质量控制标准将通用要求划分为试剂与材料、仪器设备、操作流程和实验室质量控制四个维度，形成了系统完整的技术要求体系。在试剂与材料方面，标准对LAMP反应所需的主要试剂（包括DNA聚合酶、引物、脱氧核苷三磷酸（dNTPs）、反应缓冲液、模板核酸等）的质量要求进行了规定，强调了试剂纯度和批间一致性的重要性。特别对于引物质量，标准要求对其纯度、浓度和序列准确性进行验证，并建议对每一批新合成的引物进行性能确认后方可投入常规使用。在仪器设备方面，标准要求使用具备恒温控制功能的设备（如水浴锅、恒温加热块或专用LAMP扩增仪）进行反应，并对设备的温度准确性和均一性提出了明确要求。对于采用荧光实时监测的检测模式，标准还对荧光检测系统的波长准确性和灵敏度提出了要求。在操作流程方面，标准对样品的前处理、核酸提取、反应体系配置、扩增反应设置和结果判读等关键步骤提出了规范性要求。特别强调核酸提取质量对LAMP检测结果的决定性影响，建议实验室在可能的情况下对核酸提取效率和纯度进行评价。在实验室质量控制方面，标准明确要求在每次LAMP检测中设置阳性对照、阴性对照和（建议设置）内部扩增对照。其中，阴性对照用于监测试剂污染和交叉污染，阳性对照用于验证反应体系有效性，内部扩增对照则用于监测样品中可能存在的扩增抑制物对检测结果的影响。标准还要求实验室定期参加能力验证活动，以持续评估和证明实验室的检测能力。（六）方法验证与性能评价标准对LAMP检测方法的验证要求进行了规定，包括特异性（inclusivityandexclusivity）、灵敏度（检测限）、重复性和再现性等关键性能参数的评价方法。标准要求方法开发者或使用实验室应通过系统的性能评价实验，确定所采用的LAMP方法对目标微生物检测的适用性和可靠性，并建立相应的性能指标。同时，标准规定实验室在将已发表的LAMP方法引入实验室使用前，应进行方法确认，以验证在实验室实际条件下的方法性能。四、参与制定的主要单位国际标准ISO24914:2026的制定汇聚了来自全球多个国家的标准化机构和技术专家。需要指出的是，国际标准的制定是集体智慧的结晶，最终文本反映了各参与成员体和技术专家的共同协商成果。在此，对在该标准制定过程中发挥重要作用的代表性机构——中国检验检疫科学研究院（ChineseAcademyofInspectionandQuarantine，CAIQ）进行较为详细的介绍。中国检验检疫科学研究院是国家市场监督管理总局直属的综合性科研机构，是国家设立的公益性检验检疫科技研究中央级院所，也是我国食品微生物检测领域最具权威性的科研机构之一。该院长期以来深度参与国际标准化组织食品委员会（ISO/TC34）以及食品微生物学分技术委员会（SC9）的相关工作，在食品微生物检测方法标准化领域积累了丰富的研究成果和标准化实践经验。在ISO24914的研制过程中，中国检验检疫科学研究院的研究团队充分发挥了在LAMP技术研究和应用方面的深厚积累。该院自2000年代初期即开始关注和跟踪LAMP技术的前沿发展，围绕食源性致病菌的LAMP快速检测方法开展了一系列系统性研究，在引物设计策略、反应条件优化、多目标联合检测、现场快速检测装备开发等方面取得了多项具有国际影响力的科研成果。其在LAMP技术领域积累的丰富实验数据和实践经验，为ISO24914技术内容的充实和完善提供了重要的科学支撑。在标准制定工作中，中国检验检疫科学研究院的专家团队积极参与工作组讨论，在多个关键技术议题上贡献了中国方案和中国智慧。例如，