CN119403563A 治疗剂和方法 （剑桥企业有限公司）

2024.12.16PCT/GB2023/0515902023.06.16WO2023/242595EN2023.12.21本发明涉及用于器官再生或修复的经修饰胞表现出通过钠泄漏通道(NALCN)的减少的离子22.离子通道调节剂，其用于器官再生或修复3.根据权利要求2所述使用的离子通道调节剂，其中所述离子通道调节剂靶向NALCN4.根据权利要求2或3所述使用的离子通道调节剂，其中所述离子通道调节剂靶向5.根据前述权利要求中任一项所述使用的经修饰的干细胞样细胞或离子通道调节剂，6.根据权利要求5所述使用的经修饰的干细胞样细胞或离子通道调节剂，其用于治疗7.根据前述权利要求中任一项所述使用的经修饰的干细胞样细胞或离子通道调节剂，8.药物组合物，其包含权利要求1或7所述的经修饰的9.修复或再生受试者器官的方法，其包括向受试者施使干细胞样细胞与离子通道调节剂接触，其中所述离子通道调节剂抑制通过NALCN的在干细胞样细胞中引入Nalcn突变和/或缺失Nalcn和/或降低Nalcn的表达，其中所述突变和/或缺失和/或降低的表达导致通过NALC3i)使干细胞样细胞与离子通道调节剂接触，其中所述离子通道调节剂抑制通过NALCNii)在干细胞样细胞中引入Nalcn突述突变和/或缺失和/或降低的表达导致通过NALCN的减19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中所述方法还包括扩增所述经修饰20.增加干细胞样细胞的实体组织细胞脱落水平的方法，其包括在干细胞样细胞中引入Nalcn突变和/或缺失Nalcn和/或降低Nalcn的表达，其中所述突变和/或缺失和/或降低21.增加干细胞样细胞的实体组织细胞脱落水平的方法，其包括使细胞与离子通道调26.试剂盒，其包含从受试者获得细胞样品的装置和修26.根据权利要求24或25中任一项所述的试剂盒，其还包括用于培养所述经修饰的干4[0002]再生医学是一个寻求修复或替换受损或患病的人体细胞或组织以恢复正常功能[0004]本发明人已经鉴定出单离子通道NALCN是上皮细胞脱落的关键调控因子。发明人[0007]离子通道调节剂可以靶向NALCN和/或与NALCN相关的蛋白质中的一种，其中与5[0015]该方法还可以包括修饰干细胞样细胞，使得干细胞样细胞表现出通过NALCN的减[0017]使干细胞样细胞与离子通道调节剂接触，其中所述离子通道调节剂抑制通过[0018]在干细胞样细胞中引入Nalcn突变和/或缺失Nalcn和/或降低Nalcn的表达，其中突变和/或缺失和/或降低的表达导致通过NALC[0027]i)使干细胞样细胞与离子通道调节剂接触，其中所述离子通道调节剂抑制通过胞中引入Nalcn突变和/或缺失Nalcn和/或降低Nalcn的表达，其中突变和/或缺失和/或降6源自指定的正常和恶性小鼠组织的细胞的201,183个单细胞RNA测序图谱的UMAP。(c)肾脏(f)中计数。(g)在注射P1RNalcn+/+ntCZCs或P1RNalcnFlx/FlxntCZCs的受体小鼠器官中鉴定的每只小鼠ZSG+细胞簇总数的器官热图。(h)掺入受体小鼠肾脏的P1RNalcnFlx/Flx下)小鼠肺细支气管的ZSG免疫组织化学(比例尺＝100μm)。右，Pdx1RNalcn+/+(n＝7)和Pdx1RNalcnFlx/Fl小鼠的整个肺切片中检测到的双光子直接ZSG+细胞簇。(d)掺入受体小鼠器官的尾静脉注射的P1RNalcnFlx/FlxntCZCs(箭头)的示例性共免疫荧光(箭头表示ZSG+细[0040]图3.植入的ZSG+ntCZCs表达肾脏标志物。(a)ntCZCs、植入免疫功能受损小鼠(NOD_scid_gamma_NSG)的肾脏的ZSG+ntCZCs、对照NSG肾皮质和髓质的166,878个SCS图谱标志物。浅蓝色是上皮标志物E_钙黏着蛋白。(e)表明ZSG+细胞存在的肾脏的亮场图像理动物的肾脏中分离出的每106个细胞中分选的ZSG+细7人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第4版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringH于紧张性(tonic)神经元兴奋性。NALCN的序列是已知的，可以包括ENSG00000102452中所述经修饰的干细胞样细胞表现出通过钠泄漏通道NALCN(本文称为NALCN)的减少的离NALCN的离子流可用于修复或再生受损或患病的器官8例如胃干细胞、胃峡部细胞、小肠干细胞、十二指肠转运扩增细胞(duodenaltransitamplyingcells)和表现出高度的可塑性以再生整个肿瘤的人循环肿瘤细胞。本发明的上胞/上皮到间充质转化/转移起始细胞/循环肿瘤细胞标志物(例如Zeb2、Tgfb1、Tgfbr1、9胞是上皮来源的干细胞和/或上皮干细胞。根据本发明的干细胞是能够进一步分化为或尚时间单位内更少的离子分子流过NALCN。由于NALCN是一种负责细胞静息Na+通透性的离子节剂可分类为离子通道阻断剂或离子通道开放剂(ionchannelopeners)。离子通道阻断或损害离子分子通过NALCN的通道，以便在相同的给定时间单位内更少的离子分子流过[0070]当离子通道调节剂作用于NALCN蛋白质时，可以通过结合NALCN的一个或多个α亚基来实现调节。这种调节可以是通过调节剂破坏NALCN的α亚基和辅助亚基之间的过调节剂干扰或增强电压传感器或门控机制的其他元件的直接靶向NALCN来减少通过NALCN的离子流。离子通道调节剂可以通过靶向与NALCN相关的蛋白质中的一种来减少通过NALCN的离子流。NALCN蛋白在细胞膜内形成通道体NALCN相关的这些蛋白质中的一种可以被离子通道调节剂靶向。可被离子通道调节剂靶向宁环(Nbenzhydrylquinuclidine)化合物和/或L70设这些氨基酸残基可以参与调控NALCN孔的打开。因此，通过靶向这些残基中的一个或多少通过NALCN的离子流。这种短暂的减少将允许干细胞样细胞被运输到需要再生或修复的[0081]本发明的离子通道调节剂可以不完全阻止通过NALCN的离子流，而只是简单地减[0088]如本领域技术人员将理解的，Nalcn的敲除意味着细胞没有Nalcn基因或Nalcn基[0090]在经修饰的细胞包含Nalcn突变的实施方案中，突变减少了通过NALCN的离子流。突变引入Nalcn，包括定点诱变锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)或流。NALCN内的一个或多个突变可以存在于选自但不限于以下各项的位置：L588M、P573、[0094]在干细胞样细胞已经用离子通道调节剂处理以减少通过NALCN的离子流的实施方[0098]经修饰的干细胞样细胞、离子通道调节剂或药物组合物可以通过任何合适的途是其他类似形式，还可以包括以下一种或多种：无NALCN的离子流可用于修复或再生受损或患病的器官尺寸排阻和使用定义的对于特定人群的细胞表面标志物的抗体富集方法(磁珠分选或[0120]然后，可以对干细胞样细胞进行离体修饰，使得所述干细胞样细胞表现出通过[0121]i)对干细胞样细胞进行修饰，使得所述干细胞样细胞表现出通过NALCN的减少的[0122]上文讨论了修饰干细胞样细胞以减少通过NALCN的离子流的方法。干细胞样细胞[0123]a)使干细胞样细胞与离子通道调节剂接触，其中所述离子通道调节剂抑制通过[0124]b)在干细胞样细胞中引入Nalcn突变和/或缺失Nalcn和/或降低Nalcn的表达，其[0125]该方法还可以包括扩增已被修饰以减少通过NALCN的离子流的经修饰的干细胞样CorningNutriStemhPSCXF培养基、Essential8培养基(ThermoFisherScientific)、适合干细胞样细胞的扩增。因此，培养基的温度可以是约30℃至50℃,约35℃至40℃,约36的氧气百分比可以在含氧量正常(20％O2)沿缺氧条件的梯度(0.5％O2)知的。可用于涂覆固体支持物或培养表面(例如培养板)的ECM的非限制性实例包括[0133]a.使干细胞样细胞与离子通道调节剂接触，其中所述离子通道调节剂抑制通过[0134]b.在干细胞样细胞中引入Nalcn突变和/或缺失Nalcn和/或降低Nalcn的表达，其试者可以用靶向NALCN的调节剂与经修饰的干细胞样细胞联合治疗，其中所述经修饰的干[0137]本发明还涉及经修饰的干细胞样细胞或离子通道调节剂在制备用于器官再生或或缺失和/或降低的表达导致通过NALCN的减[0144]在一个方面，本发明还涉及增加干细胞样细胞的实体组所述方法包括使细胞与离子通道调节剂接触，其中所述离子通道调节剂减少通过NALCN的[0150]i)使干细胞样细胞与离子通道调节剂接触，其中所述离子通道调节剂抑制通过[0153]该方法还可以包括扩增已被修饰以减少通过NALCN的离子流的经修饰的干细胞样所述经修饰的干细胞样细胞表现出通过NALCN的减种其他方面和实施方案对于本领域技术人员来[0161]本说明书中提到的所有文件均以引用的方式全部纳入本文，包括对基因登录号、[0170]通过用30mMEDTA/PBS灌注小鼠、胃切除和在4℃下将幽门黏膜刮入10mMEDTA/(A1370701，ThermoFisher)、N_407乙酰半胱氨酸(A9165，Sigma_Aldrich)和10nM胃泌素(G9145，Sigma_Adrich)，含有生长因子(50ng/mlEGF[Peprotech]、1mg/mlR_spondin1[0172]小鼠来源于靶向的ES细胞(UCDAVISKOMP储库敲除小鼠项目克隆EPD0383_5_NalcnFlx等位基因(UCDAVISKOMP储库敲除小鼠项目克隆EPD0GCACCAGCTATATGTCCCTCTCACG_3'(SEDIDNO.25)或对于NalcnFlx为5力_[0173]通过定量逆转录酶PCR和BioradCFX96Touch实时PCR检测系统对NalcnRNA表达通过MACSQuant分析仪(MiltenyiBiotechInc.)评估ZSgreen的表达(525/50nm[FITC]vs614/50nm[PI])。使用BDFACSAriaII细胞分选仪(BDBiosciences)在525/50nm(FITC)和614/50nm(PI)激发下对用于单细胞RNA测序和尾静脉注射的细胞进行分选。非他莫昔芬诱导的小鼠外周血作为阴性对照来设置门控参数。将25000个ZSG+细胞分选出来并注射到养基：高级DMEM/F12(31330038，ThermoFisher)、2mML_谷氨酰胺(25030024，子(50ng/mlEGF[Petrotech]、100ng/mlbFGF[10_18c，Peprotech]和1％FBS(10500064，ThermoFisher)。细胞在37℃的5％CO2中生长。受体NODSCIDγ小OCT进行组织切片和纤维化以及肾脏中ZSG+细胞的色。使用标准程序和一抗进行免疫组织化学检测，其中所述一抗为：Ki67(IHC_00375，Bethyl，1:1000)、ZSGreen(632474，Clontech，1:2000)、广谱细胞角蛋白(Pancytokeratin)(AE1/AE3)(901_011_091620，BioCareMedical，1:100)、CK5(ab52635，酶3(9664，CellSignalingTechnology，1:200)、CD31(77699,CellSignalingml)。二抗是抗兔多聚HRP__IgG(包含在试剂盒中)或兔抗大鼠(A110_322A，BethylHALO(IndicaLabs)图像[0180]为了进行免疫荧光检测，将组织切片与一抗一起孵育：罗丹明标记的DBA(RL_(ab181598，Abcam，1:200)、CK20(ab97511，Abcam，1:200)、E_钙黏着蛋白(147308,[0181]使用AdvancedCellDiagnostics(ACD)RNAscope2.5LS试剂盒RED(ACD，整个组织切片在AperioAT2(LeicaBiosystems)上成像，并使用HALO(IndicaLabs)成像专家(PeterVogel和BetaniaMahler[0185]在TissueCyte1000仪器(TissueVision,MAUSA)上进行连续双光子断层扫描用GFP标记的基准琼脂糖标记珠分布在整个包埋培养基中，以帮助重新排列样品供后续使用。[0187]用PBS灌注动物，然后用HBSS中的100U/mlIV型胶原酶灌注，所述HB解离缓冲液中：用HBSS中的200U/ml的IV型胶原酶(Sigma)和100μg/ml的DNAseI(Roche)解胶原酶(100U/ml)、分散酶(2.4U/ml)和DNAseI(100μg/ml)解离肝脏，HBSS具有含有3mMCaCl2的Ca2+和Mg2+(LifeTechnologies)介质；用在DMEM高糖、2mML_谷氨酰胺(LifeTechnologies)、1xPen_605Strep和10％胎牛血清中的木瓜蛋白酶(20U/ml)和DNAseI[0188]在测序之前，将实体组织的单细胞悬浮液进行复用(multiplex)，并用Cell个样品的条形码标记的细胞的RNA，并根据制造商的方案进行所有后续步骤以生成单细胞常低的样品)。用AgilentTapeStation4200(高灵敏度5000ScreenTape)测量cDNA的质量灵敏度D1000ScreenTape，以评估文库大小)和Qubit4.0荧光计(ThermoFisher序列数据(实体器官)，生成每个细胞的具有细胞条GSE144494)和人PBMC原始计数的Illumina10X的500个细胞的单细胞测序图谱合并到[0191]为了直接比较人CTC和小鼠tCZC，通过标准Seurat工作流程鉴定了15,328个直系离的缺乏致癌等位基因的P1；NalcnFlx/Flx胃干细胞中缺失Nalcn迅速上调