选修三专题一基因工程的基本操作程序2讲课文档

选修三专题一基因工程的基本操作程序第1页，共56页。（优选）选修三专题一基因工程的基本操作程序第2页，共56页。基因的结构（补充知识）非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点启动子终止子①RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。②转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。③转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。1、编码区：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质的序列。2、非编码区：调控遗传信息表达的核苷酸序列(启动子、终止子），不编码蛋白质。一、原核细胞的基因结构第3页，共56页。二、真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区

内含子

外显子

启动子终止子基因的结构（补充知识）与RNA聚合酶结合位点1、编码区2、非编码区：调控遗传信息表达的核苷酸序列(启动子、终止子），不编码蛋白质。外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列第4页，共56页。一、目的基因的获取获取目的基因的方法（一）从基因文库中获取目的基因基因组文库部分基因文库（cDNA文库）（二）利用PCR技术扩增目的基因（三）人工合成法（DNA合成仪）反转录法和化学合成法5第5页，共56页。基因文库将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。6第6页，共56页。限制酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装1)基因组文库(Genomiclibrary)是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。（一）从基因文库中直接获取1.基因文库第7页，共56页。（一）从基因文库中直接获取1.基因文库是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库，只包含一种生物的一部分基因。2)cDNA文库(cDNAlibrary)基因重组反转录酶mRNAcDNA第8页，共56页。cDNA文库与基因组文库的区别文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）无有基因中内含子（位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段）无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以9第9页，共56页。2.基因文库的构建方法①：直接分离法供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶受体细胞产生特定性状导入外源DNA扩增目的基因分离(鸟枪法)（一）从基因文库中直接获取多用于原核生物第10页，共56页。逆转录法目的基因的信使RNA目的基因化学合成法肽链氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成逆转录2.基因文库的构建方法（一）从基因文库中直接获取②人工合成法（真核生物）推测推测单链DNA合成第11页，共56页。（二）利用PCR技术扩增目的基因PCR多聚酶链式反应1988年穆里斯等人在生物体外复制特定DNA片断的核酸合成技术，由此可获得大量目的基因。12第12页，共56页。PCR技术原理在了解DNA一级结构基础上设计引物，DNA多聚酶可识别并结合引物，以单链DNA为模板,dNTP为底物，合成其互补链，通过反复变性，反复合成互补链的过程，达到DNA扩增的目的。13第13页，共56页。（二）利用PCR扩增目的基因1、过程高温变性（解旋为单链）低温退火（引物与单链互补结合）适温延伸（在Taq酶的作用下合成与模板互补的DNA双链）重复循环第14页，共56页。PCR循环--变性第15页，共56页。PCR循环--变性第16页，共56页。PCR循环--变性第17页，共56页。PCR循环—退火18第18页，共56页。PCR循环—延伸19第19页，共56页。PCR循环—延伸20第20页，共56页。PCR循环—延伸21第21页，共56页。PCR循环—延伸22第22页，共56页。23第23页，共56页。1、过程（二）利用PCR扩增目的基因第24页，共56页。（二）利用PCR扩增目的基因2、条件已知基因的核苷酸序列、四种dNTP、引物TaqDNA聚合酶使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增4、结果耐高温3、方式：以指数方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）2n适宜的温度和PH值第25页，共56页。作业：必修二课时作业（十六）P9926第26页，共56页。请你描述1、鸟枪法构建基因文库的过程2、化学合成法获得目的基因的过程3、逆转录法获得目的基因的过程4、PCR技术过程27第27页，共56页。二、基因表达载体的构建使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。基因表达载体目的基因启动子终止子标记基因复制原点28第28页，共56页。目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因启动子基因（目的）的首端，有特殊结构的DNA片断，RNA聚合酶识别和结合的部位启动子决定了双链的模板链终止子基因（目的）的尾端，转录终止信号标记基因为了鉴别受体细胞中是否含目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来29第29页，共56页。由RNA聚合酶所催化的转录RNA聚合酶识别启动子RNA聚合酶与启动子结合RNA合成开始RNA转录到终止子RNA聚合酶从模板链上脱落30第30页，共56页。31第31页，共56页。三、将目的基因导入受体细胞转化目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞32第32页，共56页。⒈将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法（单子叶植物）花粉管通道法33第33页，共56页。农杆菌的特点双子叶植物和裸子植物受伤时，伤口分泌酚类吸引农杆菌农杆菌移向植物细胞伤口处农杆菌的Ti质粒上的T-DNA整合到植物细胞染色体的DNA上34第34页，共56页。农杆菌转化法转入农杆菌35第35页，共56页。双子叶植物和裸子植物受伤时，伤口分泌酚类吸引农杆菌带有目的基因的农杆菌Ti质粒转移至受体细胞目的基因得以稳定维持和表达目的基因插入到植物细胞染色体的DNA上36第36页，共56页。基因枪法（微弹轰击法）利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。单子叶植物，成本高37第37页，共56页。花粉管通道法在植物授粉后，花粉形成的花粉管还没愈合前，剪去柱头，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。转基因抗虫棉简便经济38第38页，共56页。⒉将目的基因导入动物细胞-显微注射法显微注射法：将基因表达载体提纯，用显微仪注

射到受精卵中39第39页，共56页。⒉将目的基因导入动物细胞-显微注射法将含有目的基因的表达载体提纯，DNA1~3μg／mL从雌性动物取出卵（体内或体外受精）显微注射含目的基因的受精卵，移植到雌性动物的输卵管或子宫内，使其发育40第40页，共56页。⒊将目的基因导入微生物细胞原核生物（大肠杆菌）繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少41第41页，共56页。⒊将目的基因导入微生物细胞用Ca2＋处理细菌感受态细胞：增大细胞壁的通透性，吸收周围环境中DNA分子重组表达载体DNA溶于缓冲液与感受态细胞混合在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子42第42页，共56页。本堂课作业：下发资料1.1~1.2核心考点、双基考题部分国庆作业：下发资料：高考题43第43页，共56页。四、目的基因的检测与鉴定检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因DNA分子杂交技术检测目的基因是否转录出了mRNA分子杂交技术检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原－抗体杂交分子水平的检测44第44页，共56页。⒈检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因DNA分子杂交技术探针含有目的基因的DNA片段用放射性同位素作标记转基因生物的基因组DNA待测若出现杂交带，表明目的基因已插入染色体的DNA中45第45页，共56页。2.检测目的基因是否转录出了mRNA分子杂交技术探针含有目的基因的DNA片段用放射性同位素作标记从转基因生物中提取mRNA待测若出现杂交带，表明目的基因已转录出mRNA46第46页，共56页。3.检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原-抗体杂交若出现杂交带，表明目的基因已形成蛋白质产品47第47页，共56页。4.个体生物学水平的鉴定抗虫或抗病的接种实验，以确定是否具有抗性以及抗性的程度有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能活性是否与天然产品相同48第48页，共56页。DNA探针将双链DNA解开用同位素、荧光分子或化学发光剂等对DNA单链进行标记抽取病人的组织或体液，将DNA分离出来使DNA解旋查出疾病将DNA探针引入到化验样品中分析遗留在样品中的DNA探针49第49页，共56页。利用基因的特性破案50第50页，共56页。生物材料DNAmRNA限制酶切割一定大小范围DNA基因组文库PCR反转录cDNAcDNA文库获取目的基因人工合成51第51页，共56页。P15－1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？答：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。52第52页，共56页。P15－思考与探究－－2提示：农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在植物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中。据不完全统计，约有93属643种双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。裸子植物对该菌也敏感。当这些植物被该菌侵染后会诱发肿瘤。近年来，也有报道该菌对单子叶植物也有侵染能力。根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根瘤农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。近年来还发现一些中性糖，如53第53页，共56页。P15－思考与探究－－2L-阿拉伯糖、D-木糖等也有诱导作用。酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中Ti质粒上Vir区（毒性区）基因的诱导物，使Vir区基因活化，导致T-DNA的加工和转移，从而侵染植物细胞。需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力有差别，在基因工程中需要加以选择使用。利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的，同时单子叶植物种类不同，农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物