CN119410566A 高产硫酸软骨素的重组菌株及其应用和硫酸软骨素的制备方法 （内蒙古金达威药业有限公司）

高产硫酸软骨素的重组菌株及其应用和硫本发明属于硫酸软骨素生物合成的技术领组菌株能够同时表达UDP一氨基葡萄糖异构酶、代谢途径共同构成了具有高效合成CSA能力的酶联级路径，能够实现CSA的高产量以及高纯度的2所述UDP氨基葡萄糖异构酶包括序列如SEQIDNO:10所示的氨基酸片所述UDP葡萄糖脱氢酶包括序列如SEQIDNO:11所示的氨基酸片段酶包括序列如SEQIDNO:12所示的氨基所述氨基葡萄糖合成酶包括序列如SEQIDNO:22所示的氨所述磷酸葡萄糖胺变位酶包括序列如SEQIDNO:23所示的氨所述UDPN乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶包括序列如SEQIDNO:24所示的氨基酸所述葡萄糖6磷酸异构酶包括序列如SEQIDNO:34所示的氨基酸所述葡萄糖磷酸变位酶包括序列如SEQIDNO:35所示的氨所述葡萄糖1磷酸尿苷酰转移酶包括序列如SEQIDNO:36所示的所述ATP磺化酶包括序列如SEQIDNO:49所示的氨所述磺基转移酶包括序列如SEQIDNO:50所示的氨所述丙酮酸激酶包括序列如SEQIDNO:51所示的氨所述APS激酶包括序列如SEQIDNO:52所示的氨编码所述UDP氨基葡萄糖异构酶的KfoA基因包括序列如SEQIDNO:1所示的核苷酸片编码所述软骨素聚合酶的KfoC基因包括序列如SEQID编码所述氨基葡萄糖合成酶的GlmS基因包括序列如SEQIDN编码所述磷酸葡萄糖胺变位酶的GlmM基因包括序列如SEQIDNO:14所示的核苷酸片编码所述UDPN乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶的GlmU基因包括序列如SEQIDNO:15所编码所述葡萄糖磷酸变位酶的Pgm基因包括序列如SEQIDN编码所述葡萄糖1磷酸尿苷酰转移酶的GalU基因包括序列如SEQIDNO:27所示的核编码所述ATP磺化酶的ATPS基因包括序列如SEQIDN编码所述磺基转移酶的ST基因包括序列如SEQIDN3编码所述丙酮酸激酶的pykA基因包括序列如SEQIDN编码所述APS激酶的APSK基因包括序列如SEQIDN5.权利要求1~4中任意一项所述的产硫酸软骨素的重组菌株在微生物发酵法制备硫酸意一项所述的产硫酸软骨素的重组菌株进行发4键交替连接，并经过磺基转移酶对不同位点的磺酸化修饰形成的。磺酸化修饰指的是利用相应的磺基转移酶催化磺酸基团转移至GlcA的C_2位羟基或者GalNAc中C_4/C_6位羟基上的过程。根据结构中磺酸化修饰的位点不同，可将CS分为CSA（GlcA_GalNAc(4S)）、CSC[0005]在公开号为CN102869782A的中国发明中公开了通过E.coliO5:K4:H4的发酵制备[0007]本发明的第二目的在于提供上述产硫酸软骨素的重组菌株在微生物发酵法制备534所示的氨基酸片段；所述葡萄糖磷酸变位酶包括序列如SEQIDNO:35所示的氨基酸片段；所述葡萄糖1磷酸尿苷酰转移酶包括序列如SEQIDNO:36所示的氨基酸片段；所述ATP磺化酶包括序列如SEQIDNO:49所示的氨基酸片段；所述磺基转移酶包括序列如SEQIDNO:50所示的氨基酸片段；所述丙酮酸激酶包括序列如SEQIDNO:51所示的氨基酸片基因包括序列如SEQIDNO:2所示的核苷酸片段；编码所述软骨素聚合酶的KfoC基因包括序列如SEQIDNO:3所示的核苷酸片段；编码所述氨基葡萄糖合成酶的GlmS基因包括序列括序列如SEQIDNO:25所示的核苷酸片段；编码所述葡萄糖磷酸变位酶的Pgm基因包括序包括序列如SEQIDNO:27所示的核苷酸片段；编码所述ATP磺化酶的ATPS基因包括序列如[0013]本发明还提供了上述产硫酸软骨素的重组菌株在微生物发酵法制备硫酸软骨素6的碳代谢途径共同构成了具有高效合成CSA能力的酶联级路径，从而赋予其高效合成得到酮酸激酶以及APS激酶的表达，与宿主细胞中原有的碳代谢途径共同构成了完整且具有高效合成CSA能力的酶联级路径，以在细胞内实现前体软骨素的高质量供应以及对于软骨素转变为UDPN乙酰氨基半乳糖的生物活性的一类酶分子，以能够实现相应催化活性为限，[0026]在一些具体的实施方式中，所述UDP一氨基葡萄糖异构酶优选包括序列7氨基葡萄糖异构酶的氨基酸序列，本领域技术人员容易获得所述KfoA基因的核苷酸序列，本发明并不对该KfoA基因具体的核苷酸序列加以特[0028]在一些具体的实施方式中，所述KfoA基因优选包括序列如SEQIDNO:1所示的核不对该KfoF基因具体的核苷酸序列加以特别的[0032]在一些具体的实施方式中，所述KfoF基因优选包括序列如SEQIDNO:2所示的核的氨基酸序列，本领域技术人员容易获得所述KfoC基因的核苷酸序列，本发明并不对该[0036]在一些具体的实施方式中，所述KfoC基因优选包括序列如SEQIDNO:3所示的核8不对该GlmS基因具体的核苷酸序列加以特别的于所述UDPN乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶的氨基酸序列，本领域技术人员容易获得所述9[0052]在一些具体的实施方式中，所述Pgi基因优选包括序列如SEQIDNO:25所示的核[0056]在一些具体的实施方式中，所述Pgm基因优选包括序列如SEQIDNO:26所示的核葡萄糖1磷酸尿苷酰转移酶的氨基酸序列，本领域技术人员容易获得所述GalU基因的核[0062]在一些具体的实施方式中，所述ATP磺化酶优选包括序列如SEQIDNO:49所[0065]在本发明中，所述磺基转移酶指的是具有催化PAPS和硫酸软骨素反应生成CSA的[0074]在一些具体的实施方式中，所述APS激酶优选包括序列如SEQIDNO:52所示[0077]在本发明中，构建所述重组菌株所使用的宿主细胞优选为大肠杆菌BL21Star内所具有甘油代谢途径以及上述酶分子所构成的CSA合成酶联级路径具有更加理想的CSA酸软骨素的重组菌株在微生物发酵法制备硫酸软骨素中的应用。采用该发酵培养基对上述重组菌株进行培养，所获得的CSA具有更好的纯度以及磺酸化水[0086]在一些具体的实施方式中，步骤S1中，所述预培养的条件包括温度优选为35~40[0087]在发明中，步骤S2中，所述诱导表达剂指的是能够诱导ATPS_ST_pykA_APSK/GlmS_GlmM_GlmU_Pgi_Pgm_GalU/KfoA_KfoC_KfoF基因簇在重组菌株细胞表达的一类物质，基添加至预处理培养液以调控预处理培养液的溶氧量为15~[0091]在一些具体的实施方式中，所述补料培养基优选包括250~1000g/L的甘油，如[0095]表1.[0097]PCR扩增的反应程序包括：95℃3min，25个循环（95℃20s，55℃20s，72℃2min72℃10min。[0101]表2.本制备例用以说明一种重组菌株的制备，该重组菌株中包括有GlmS_GlmM_GlmU/[0104]表3.[0106]PCR扩增的反应程序包括：95℃3min，25个循环（95℃20s，55℃20s，72℃2min72℃10min。[0110]表4.本制备例用以说明一种重组菌株的制备，该重组菌株中包括有GlmS_GlmM_GlmU_的构建1）采用细菌基因组DNA快速提取试剂盒并参照说明书对大肠杆菌K4(ATCC23502)[0113]表5.[0115]PCR扩增的反应程序包括：95℃3min，25个循环（95℃20s，55℃20s，72℃2min72℃10min。[0119]表6.本制备例用以说明一种重组菌株的制备，该重组菌株中包括有ATPS_ST_pykA_行凝胶电泳，采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒并参照说明书对对应条带进行回收，得到[0122]表7.[0124]PCR扩增的反应程序包括：95℃3min，25个循环（95℃20s，55℃20s，72℃2min72℃10min。着采用同源重组无缝克隆试剂盒并根据说明书将酶切表达载体pCDFduet_1与ATPS、ST、[0128]表8.本制备例用以说明一种重组菌株的制备，该重组菌株中包括有ATPS_ST_pykA_取制备例2提供的重组质粒II、制备例4提供的重组质粒IV转化到大肠杆菌BL21本制备例用以说明一种重组菌株的制备，该重组菌株中包括有ATPS’_ST’_[0132]表9.[0134]表10.本实施例用以说明以上制备例提供的重组菌株在摇瓶培养规模上用以合成硫酸S1、按照1%的接种量从甘油管分别取200μL的包含上述重组菌株的菌液接种于LB[0140]其中，HPLC检测的条件包括：液相色谱仪带DAD检测器；色谱柱为ZORBAXSAX间为50min。12h后，采用沸水浴对硫酸软骨素裂解酶ABC进行灭活处理10min，于12000×g下高速离心采用负离子扫描模式，扫描质量范围设置为100~1000m/z，ESI电离模式，毛细管电压为[0143]表11.[0144]由表11所示的测试结果可知，相较于制备例1~3以及5提供的重组菌株C1~C3以及C5，制备例4和6提供的重组菌株C4和C6是以大肠杆菌BL21Star(DE3)或毕赤酵母GS115作为宿主细胞，引入ATPS_ST_pykA_APSK/GlmS_GlmM_GlmU_Pgi_Pgm_GalU/KfoA_KfoC_KfoF本实施例用以说明以上制备例提供的重组菌株在发酵罐培养规模上用以合成硫以溶氧恒定为30%方式流加补料培养基使培养液的溶氧保持在25%以上；当培养液的OD600=[0148]S3、按照实施例1中提供的方法对发酵上清液中的CSA浓度以及CSA磺酸化水平进[0149]表12.[0150]由表12所示的测试结果可知，相较于制备例1~3以及5提供的重组菌株C1~C3以及[0153]表13.