CN119410580A 一种nk细胞的体外扩增培养方法 （潍坊吉涛医学科技有限公司）

2S6：完成S5步骤中离心处理后，吸取离心液中间的白胞悬液平均分配至两个T225培养瓶中，每个培养瓶中均加入步骤S4中制备的预处理血浆，S14：将营养增补液和OptiVitroT细胞无血清培养基以0.8:9.2的体积比例混匀配成3S18：在完成步骤S17的第七次补液操作后的第2～A2：将步骤A1所制备的海藻酸钠溶液和羟丙基甲基纤维素溶液等OK432和IL15的添加使用浓度均为1μg/mL；步骤S10中所述OK432和IL15的添加使用浓度8.根据权利要求7所述的一种NK细胞的体外扩增培养方9.根据权利要求8所述的一种NK细胞的体外扩增培养方45[0002]自然杀伤细胞(NaturalKillerCells,NKCells)是先天免疫系统中的一种重NK细胞不依赖于特异性抗原受体，具有天然的细胞毒性，6S7：将RPMI_1640培养基和营养增补液以9:1的体积比例混合均匀配成完全培养L:15μL:1.5mL的比例混合充分混匀后，缓慢加入培养瓶中，确保培养瓶中液体终体积为制备的完全培养液和步骤S4中制备的预处理血浆按照32mL:3mL的比例加入到50mL离心管理血浆，然后用步骤S7制备的完全培养液补充每个培养瓶中液体终体积至200mL，共计7淋巴细胞分离液以PBS缓冲液为溶剂通过Ficoll密度梯度离心8装袋操作为NK细胞的规模化扩增提供足够的空间，防止了细胞过度密集引发的生长抑制；养增补液中的生长因子和营养补充剂能够支持NK细胞的增殖，并提供必要的抗氧化保护，化能力，这种保护液的应用确保了NK细胞在冷冻保存后能够迅速恢复其增殖能力和活性，图5是本发明实施例2和对比例2～3扩增培养后NK细胞的生物活性测试IFN_γ释9S3：室温下，对步骤S2中处理后的全血进行离心处理，设置参数1800rpm/S4：将步骤S3中灭活后的血浆置于4℃冰箱20min，然后从冰箱取出血浆，以S7：将RPMI_1640培养基和营养增补液以9:1的体积比例混合均匀配成完全培养备的完全培养液和步骤S4中制备的预处理血浆按照32mL:3mL的比例加入到50mL离心管中的细胞悬液平均分配至两个T225培养瓶中，每个培养瓶中加入6mL步骤S4中制备的预处理养瓶，确保培养袋液体终体积为800mL；装袋完成后以同样操作对步骤S15中的T225一3和A2：将步骤A1中制备的100mL海藻酸钠溶液加入到100mL羟丙基甲基纤维素溶液S3：室温下，对步骤S2中处理后的全血进行离心处理，设置参数1800rpm/S4：将步骤S3中灭活后的血浆置于4℃冰箱28min，然后从冰箱取出血浆，以S7：将RPMI_1640培养基和营养增补液以9:1的体积比例混合均匀配成完全培养备的完全培养液和步骤S4中制备的预处理血浆按照32mL:3mL的比例加入到50mL离心管中的细胞悬液平均分配至两个T225培养瓶中，每个培养瓶中加入7mL步骤S4中制备的预处理养瓶，确保培养袋液体终体积为800mL；装袋完成后以同样操作对步骤S15中的T225_3和A2：将步骤A1中制备的100mL海藻酸钠溶液加入到100mL羟丙基甲基纤维素溶液S3：室温下，对步骤S2中处理后的全血进行离心处理，设置参数1800rpm/S4：将步骤S3中灭活后的血浆置于4℃冰箱30min，然后从冰箱取出血浆，以S7：将RPMI_1640培养基和营养增补液以9:1的体积比例混合均匀配成完全培养备的完全培养液和步骤S4中制备的预处理血浆按照32mL:3mL的比例加入到50mL离心管中的细胞悬液平均分配至两个T225培养瓶中，每个培养瓶中加入6.5mL步骤S4中制备的预处理血浆，然后用步骤S7制备的完全培养液补充每个培养瓶中液体终体积至200mL，共计养瓶，确保培养袋液体终体积为800mL；装袋完成后以同样操作对步骤S15中的T225_3和A2：将步骤A1中制备的100mL海藻酸钠溶液加入到100mL羟丙基甲基纤维素溶液S7：将RPMI1640培养基和营养增补液以9:1的体积比例混合均匀配成完全培养外记录第9天的扩增倍率，然后计算扩增倍率(扩增倍率=特定时间细胞数量/起始细胞数2～3扩增培养后的NK细胞分别调整至1×10LDH释放量_靶细胞自发释放量)/(靶细胞最大释放量_靶细胞自发释放量)×100%。结果如[0029]由图4的结果可知，本发明制备的营养保存液可以有效保护扩增培养后的细胞活[0030]细胞活性测试(IFN_γ释放试验)：所用试剂操作基本同上述细胞毒性测试；将K562细胞调整至1×106cells/mL的密度，并将实施例2和对比例2～3扩增培养后的NK细胞分别调整至1×106cells/mL，将K562细胞段补液