CN119410608A 靶向性修饰植物基因组序列的方法 （苏州齐禾生科生物科技有限公司）

202080077133.22020.09.25桑田街218号生物医药产业园二期乐提供了一种通过向导RNA指导的核酸酶一逆转录酶融合蛋白将植物基因组中的特定序列靶2一一i)融合蛋白和/或含有编码所述融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体，其中所述融合其中所述pegRNA对中的两种pegRNA被设置为靶向基因组DNA的不同链上的其中pegRNA中的引导序列被设置为与靶序列具有充分序列相同其中所述至少一种pegRNA能够与所述融合蛋白形成复合物并将所述融合蛋白靶向基其中所述RT模板序列被设置为包含期望的修饰，所述修饰包括一或多个核苷酸的取其中所述pegRNA对中的两种pegRNA被设置为导入相基酸序列。3.权利要求1的系统，其中所述逆转录酶是氨基酸序列是MLV逆转录酶，或者所述逆转录酶是SEQIDNO:5所示的CaMV逆转录酶或SEQIDNO:6所示5.权利要求1_4中任一项的系统，其中所述引6.权利要求1_4中任一项的系统，其中所述引物结合序列的Tm(解链温度)为24℃_367.权利要求6的系统，所述pegRNA对中的一种pegR9.权利要求8的系统，其中针对有义链的pegRNA诱导的切口位于待修饰位点的上游(5’11.一种产生经遗传修饰的植物的方法，包括将权利要求1_10中任一项定义的基因组12.权利要求11的方法，其中所述导入包括将权利要求1_10中任一项定义的基因组编所述导入包括将权利要求1_10中任一项定义的基因组编辑系统转化至完整植物上的13.权利要求12的方法，所述方法还包括在升高的温度下培养已经导入所述基因组编34胞依照供体模板进行修复。实验结果表明该系统在植物中有效地诱导目标位点的精准修的nickingsgRNA的系统命名为(PPE2)；提供额外的有助于切割pegRNA相对链的nickingsgRNA的系统命名为(PPE3)；当切割相对链的nickingsgRNA的PAM序列位于pegRNA的5[0013]图6：流式细胞仪测定PPE系统的效率。“CK”为未经质新获得的数据比较不同Tm指导的PBS长度对编辑[0033]图26：使用单pegRNA和双pegRNA策略进行引发编辑的示意图。(a)仅使用NGG_[0036]图29：理论上可以通过单个pegRNA和双_pegRNA的引发编辑可靶向的水稻基因组6由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷不包含N端由起始密码子编码的甲硫氨酸，然而此时也涵盖包含该甲硫氨酸的序列，相应[0042]“经遗传修饰的植物”意指在其基因组内包含外源多核苷酸或包含经修饰的基因基因或表达调控序列为在植物基因组中所述基因或表达调控序列包含一个或多个脱氧核通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基羟化和ADP核糖基化。(如转录生成mRNA或功能RNA)和/或RNA翻译7列。[0050]“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。在本发明的一些实施方案是组成型启动子或组织特异性启动子或发育调控启动子或[0051]“组成型启动子”指一般将引起基因在多数细胞类型中在多数情况下表达的启动子的实例包括鸡RNApolI启动子。polII启动子的实例包括8[0058]在一方面，本发明涉及一种用于靶向性修饰生物体基因组DNA序列的基因组编辑[0059]i)融合蛋白和/或含有编码所述融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体，其中所述[0060]ii)至少一种pegRNA和/或含有编码所述至少一种pegRNA的核苷酸序列的表达构且相对于野生型SpCas9至少包含氨基酸取代H840A。示例性的野生型SpCas9包含SEQID列。在一些实施方案中，所述融合蛋白中的Cas9切口酶能够在靶序列的PAM的_3位核苷酸[0068]在一些实施方案中，所述Cas9切口酶是能够识别改变的PAM序列的Cas9切口酶变[0069]本发明所述Cas9切口酶形成的切口能够导致靶序列形成具有3’末端的游离单链[0070]在一些实施方案中，本发明的融合蛋白中的所述逆转录酶可以衍生自不同来述逆转录酶是M_MLV逆转录酶或其功能性变体。示例性的野生型M_MLV逆转录酶序列如SEQ9花椰菜花叶病毒(CaMV,Cauliflowermosaicvirus)的CaMV_RT，其氨基酸序列如SEQID[0074]本发明的至少一种pegRNA中的引导序列(也称种子序列或spacer序列)被设置为[0075]本领域已知多种适合用于基于CRISPR核酸酶(例如Cas9)的基因组编辑的gRNA的[0077]所述引物结合序列取决于所使用的CRISPR切口酶在靶序列中形成的游离单链的[0078]在一些实施方案中，所述引物结合序列被设置为具有不超过大约52℃的Tm(解链[0079]计算核酸序列的Tm的方法为本领域公知，例如可以使用OligoAnalysisTool在可以通过选择合适的靶序列来获得具有合适的Tm的PBS息可以被整合进靶序列所在的DNA链(也即包含靶序列PAM的链)，再通过细胞的DNA修复作[0081]在一些实施方式中，所述RT模板序列被设置为对应于靶序列切口下游的序列(例录(RT)模板序列和引物结合位点(PBS[0084]本发明的切口gRNA中的引导序列(也称种子序列或spacer序列)被设置为与基因组中切口靶序列具有充分序列相同性(优选100成的切口和所述pegRNA形成的切口相距大约1个_大约300个或更多个核苷酸，例如相距1pegRNA形成的上游或下游(所述上游或下游均参照pegRNA靶序列所在的DNA链)。在一些实施方案中，所述切口gRNA中的引导序列与pegRNA靶序列在编辑事件发生后的相对链(经修[0085]在一些实施方案中，所述的pegRNA和/或切口gRNA可以使用自加工系统对其序列[0086]在一些实施方案中，所述基因组编辑系统包含至少一对pegRNA和/或含有编码所种pegRNA被设置为靶向基因组DNA的相同链上的不同靶序列。在一些实施方案中，所述pegRNA对中的两种pegRNA被设置为靶向基因组DNA的不同链上的靶序列。在一些实施方案核苷酸序列针对其基因组待进行修饰的植物物种进[0089]密码子优化是指通过用在宿主细胞的基因中更频繁地或者最频繁地使用的密码个密码子同时维持该天然氨基酸序列而修饰核酸序列以便增强在感兴趣宿主细胞中的表认为依赖于被翻译的密码子的性质和特定的转运RNA(tRNA)分子的可用性。细胞内选定的优化在给定生物中的最佳基因表达。密码子利用率表可以容易地获得，例如在编码或包含SEQIDNO:12_14任一所[0091]可以通过本发明的基因组编辑系统进行基因组修饰的植物包括单子叶植物和双[0092]在一方面，本发明提供一种确定本发明的基因组编辑系统的pegRNA中的PBS序列[0093]a)根据所使用的CRISPR切口酶识别的PAM和待修饰位点确定至少一个候选靶序状相关，由此所述修饰取代导致所述植物相对于野生型植物具有改变的(优选改善的)性[0109]在一些实施方式中，所述方法还包括筛选具有期望的修饰和/或期望的性状如农[0110]在本发明的一些实施方式中，所述方法还包括获得所述经遗传修饰的植物的后代。优选地，所述经遗传修饰的植物或其后代具有期望的修饰和/或期望的性状如农艺性[0117]使用Gibson法将pegRNA片段(包括RT及PBS序列)构建至OsU3启动子启动的载体上，获得适用于水稻的OsU3_pegRNA构建体。使用Gibson法将5’端及3’端均带有核酶的pegRNA片段(包括RT及PBS序列)构建至玉米Ubiquitin_1[0118]通过T4连接酶将nickinggRNA构建至TaU3启动子启动的载体上，获得TaU3_nick[0130]种子先用75％乙醇漂洗1分钟，再用4％次氯酸钠处理30分钟，无菌水洗涤5次以[0133](2)加30_50mLW5稀释酶解产物，用75μm尼龙滤膜过滤酶解液于圆底离心管中[0138](1)分别加所需转化载体各10μg于2mL离心管，混匀后，用去尖的枪头吸取200μL[0145](2)加30_50mLW5稀释酶解产物，用75μm尼龙滤膜过滤酶解液于圆底离心管中[0160](7)对已经准备好的培养在流式管中的原生质体样品依次进行上样，记录相关数[0164]收集原生质体于2mL离心管中，利用CTAB法提取原生质体DNA(～30μL)，并利用[0166](1)利用基因组引物对原生质体DNA模板进行PCR扩增。20μL扩增体系包含4μL5×[0167](2)上述扩增产物稀释10倍，取1μL作为第二轮PCR扩增模板，扩增引物为含有[0168](3)PCR产物于2％琼脂糖凝胶电泳分离，并利用AxyPrepDNAGelExtraction取100ng回收产物进行混合，并送生工生物工程有限公司进行扩增子测序文库构建及扩增验的不同基因靶向位点上对产物的编辑类型及编辑效率进行比[0170]实施例1、Cas9(H840A)切口酶_逆转录酶融合系统在水稻原生质体中对BFP变GFP[0171]为了测试Cas9(H840A)切口酶_逆转录酶融合(PPEs，plantprimeeditors)是否(即PPE3b_CaMV)或来源于细菌retron系统的逆转录酶(即PPE3b_retron)同样可以使细胞[0172]实施例2、Cas9(H840A)切口酶_逆转录酶融合系统可以在水稻和小麦原生质体中精确修改基因组序列[0173]为了测试PPE系统是否可以水稻内源位点上工作，针对10个水稻内源位点(OsCDC48_T1、OsCDC48_T2、OsCDC48_T3、OsALS_T1、OsALS_T2、OsDEP1、OsEPSPS_T1、是否能在这些内源位点上工作。结果表明PPE2和PPE3(或PPE3b)系统都可以在水稻内源位通过核酶加工的带有靶点引导RNA及RT和PBS序列的pegRNA的构建体替换原系统中OsU3驱T1为测试位点的结果表明，所测试的不同的PBS长度(6_16nt)和RT模板长度(7_23nt)都能在OsCDC48_T2位点上效率为0.9％至8.1在OsALS_T2位点上效率为1.1％至10.5结果表明不同长度的RT模板和PBS会对编辑效率有显著的影响，并且发现不同的RT模板长度对也会影响PPE系统的效率，在OsCDC48_T1位点上效率为3.2％至19.2在OsCDC48_T2位点株OsCDC48_T1位点发生预期的精准删除的水稻幼苗，编辑效率为21.8％(12/55)；2株株OsCDC48_T1位点发生预期的精准的3对碱基对同时突变的水稻幼苗，编辑效率为2.6%上结果表明PPE系统可以在植物中获得定向修改的突[0187]首先根据公开数据评估了控制Tm的PBS长度对植物引发编辑的影响(图24)。结果[0188]然后评估了使用Tm为18℃至52℃的PBS(对应于6nt至17nt的PBS长度)的PPE在水稻原生质体中四个靶位点(OsACC_T1、OsCDC48_T3、OsEPSPS_T1,和OsPDS_T1)上的编辑效率。结果见图24。当PBSTm接近30℃(OsACC_T1中为24_30℃,OsEPSPS_T1中为26_34℃,OsCDC48_T3中为28_36℃,OsPDS_T1中为30℃)时，pegRNA具有更高的活性。在这些PBSTm[0189]然后，对所有13个靶位点在不同PBSTm下的PPE的整体编辑效率进行了归一化和向和反向DNA链的不同pegRNA(分别称为NGG_pegRNA和CCN_pegRNA)，其同时编码相同编辑[0197]正如预期的那样，双_pegRNA策略在大多数靶位点(15个中的13个)中具有最高的[0198]双_pegRNA在所有测试位点的编辑效率比单个NGG_pegRNA高约4.2倍(OsNRT1.1B[0199]基于水稻参考基因组(Os_NipponbarereferenceIRGSP_1.0)的计算分析表明，与具有NGPAM的SpCas9_