CN119410681A 通过强化大肠杆菌c1代谢途径提高l-组氨酸发酵产量的方法 （北京绿色康成生物技术有限公司）

通过强化大肠杆菌C1代谢途径提高L-组氨过强化大肠杆菌C1代谢途径提高L一组氨酸发酵autoethanogenum)、需钠弧菌（Vibrio2基因通过质粒导入大肠杆菌中或通过基因工程手段整合到大肠杆来自甲基营养杆菌、自养产乙醇梭菌或需钠弧菌的fhs基因通过质粒导入大肠杆菌中或通所述大肠杆菌为具有组氨酸生产能力的大肠杆菌，其表达如SEQIDNO:7所示的基因来自甲基营养杆菌、自养产乙醇梭菌或需钠弧菌的fhs基因序列所编码的蛋白质的氨3[0003]本发明的目的是提供一种通过强化大肠杆菌C1代谢途径提高L一组氨酸发酵产量通过选择优化glyA和folD基因的表达强化fTHF的供应，但此策略存在改造靶点较多，多靶点表达强度适配性的问题，易影响菌株的生长。在其他菌种中，例如甲基营养杆菌提高L组氨酸发酵产量的方法，强化大肠杆菌C1代谢途径的方法为：将来自甲基营养合到大肠杆菌基因组上。的蛋白质的氨基酸序列分别如SEQIDNO:4一6所示，在NCBI中的登录号分别为WP_4大肠杆菌中或通过基因工程手段整合到大肠杆菌基因[0008]所述大肠杆菌为具有组氨酸生产能力的大肠杆菌，其表达如SEQIDNO:7所atcggttactggtggaaactga_3/)和fhs_U_R（5/_gagccggatgattaattgtcaaaattgagagtgctccR（5/_gtggatgggacagtcagtaaaggggtgg_3/）为引物进行PCR，获得基因片段fhs_DOWN行重叠延伸PCR，分别获得打靶片段fhsUP_Ptrc_fhsMex_fhsDOWN、fhsUP_Ptrc_fhsCau_Yang,J.J.,andYang,S.(2015).MultigeneeditinggenomeviatheCRISPR_Cas9system.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,81:2506–2514，购自Addgene以引物fhs_N20_F（5/fhsUP_Ptrc_fhsVna_fhsDOWN和质粒pTarget_fhs及质粒pCas9（Jiang,Y.,Chen,B.,theEscherichiacoligenomeviatheCRISPR_Cas9system.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,81:2506–2514，购自Addgene）共同转化到大肠杆菌（6）在大肠杆菌中，操纵子hisGDCBHAFI基因编码组氨酸合成途径的一系列关键5该基因片段连接到载体pTrc99a（Budiardjo,S.J.,Stevens,J.J.,CalkinTolC.eLife,11,e73297，购自Addgene）上，获得的重组质粒命名为pTrc99a_（7）用重组质粒pTrc99a_hisGDCBHAFI转化菌株E.coil_Ptrc_fhsMex、E.coil_别如SEQIDNO:1_3所示；将该片段连接到载体pBbA1K（Lee,T.S.,Krupa,R.A.,D.(2011).BglBrickvectorsanddatasheets:Asyntheticbiologyplatformforgeneexpression.JournalofBiologicalEngineering,5,12，购自（3）分别将重组质粒pBbA1K_fhsMex、pBbA1K_fhsCau、pBbA1K_fhsVna与pTrc99a_hisGDCBHAFI共同转化到大肠杆菌MG1655中，获得的重组菌分别命名为MG1655/pTrc99a_hisGDCBHAFIHpBbA1K_fhsMex、MG1655/pTrc99a_hisGDCBHAFIHpBbA1K_fhsCau、MG1655/本发明提供了一种提高大肠杆菌中C1供应的方法，通过额外引入甲基营养杆菌 L_组氨酸的产量提高50_167%。基营养杆菌（Methylobacteriumextorquens）、自养产乙醇梭菌(Clostridium6fhs_U_F(atcggttactggtggaaactga)和fhs_U_R（gagccggatgattaattgtcaaaattgagagtgct杆菌MG1655的基因组为模板，以引物fhs_D_F（tccgtaagacgttggggagactaag）和fhs_D_R重叠延伸PCR，获得打靶片段fhsUP_Ptrc_fhsMex_fhsDOWN、fhsUP_Ptrc_fhsCau_fhsDOWN、pTarget为模板，以引物fhs_N20_F（gggtcacccgccatataacggttttagagctagaaatagcaagt获得pTarget_fhs。利用电穿孔仪（伯乐）分别将打靶片段fhsUP_Ptrc_fhsMex_fhsDOWN、fhsUP_Ptrc_fhsCau_fhsDOWN、fhsUP_Ptrc_fhsVnaID1_3所示。ptsG_UP_R（caacgtcttacggaaattgagagtgctcctgagtatg）为引物进行PCR，获得基因片段ptsG_UP约500bp并进行PCR产物纯化。以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，以引物ptsG_7[0022]以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，以hisG_F(atgttgaaaatcgctgtcccaaacaaag因片段hisGDCBHAFI，将该片段连接到载体pTrc99a上，获得的重组质粒命名为pTrc99a_hisGDCBHAFI。将重组质粒pTrc99a_hisGDCBHAFI通过电转化（条件如上）转入到菌株组菌株命名为E.coil_ptsG::Ptrc_fhsMex/pTrc99a_hisGDCBHAFI、E.coil_ptsG::Ptrc_fhsCau/pTrc99a_hisGDCBHAFI、E.coil_ptsG::Ptrc_fhsVna/pTrc99a_hisGDCBHAFI和E.coil_△ptsG/pTrc99a_hisGDCBHAF人工合成来源于M.extorquens、C.autoethanogenum和V.natriegens的fhs基物hisG_F(atgttgaaaatcgctgtcccaaacaaaggctcg)和hisI_R（tcactgatgccgtttacgcaggttctcaattaccgtcgtt）为引物进行PCR，获得基因片段hisGDCBHAFI,将该片段连接到载体化转入到MG1655中，获得的重组菌株命名为MG1655/pTrc99a_hisGDCBHAFIHpBbA1K_fhsMex、MG1655/pTrc99a_hisGDCBHAFIHpBbA1K_fhsCau和MG1655/pTrc99a_hisGDCBHAFIH将重组菌株E.coil_ptsG::Ptrc_fhsMex/pTrcMG1655/pTrc99a_hisGDCBHAFIHpBbA1K_fhsMex、MG1655/pTrc99a_hisGDCBHAFIHpBbA1K_fhsCau和MG1655/pTrc99a_hisGDCBHAFIHpBbA1K_fhsVna在LB平板上过夜培养。从该新鲜平[0025]以5%的接种量接种到含有50ml发酵培养基的500ml带档板摇瓶中，37℃ptsG::Ptrc_fhsMex/pTrc99a_hisGDCBHAFI、E.coil_ptsG::Pt