2025 猪圆环病毒病诊断技术

GB/T21674—2025

目次

前言

…………………………Ⅲ

引言

…………………………Ⅳ

范围

1………………………1

规范性引用文件

2…………………………1

术语和定义

3………………1

缩略语

4……………………1

临床诊断

5…………………2

样品采集保存与运输

6、……………………3

病毒分离与鉴定

7…………………………3

聚合酶链式反应

8(PCR)…………………5

实时荧光聚合酶链式反应

9(Real-timePCR)……………7

间接酶联免疫吸附试验间接

10(ELISA)………………9

阻断酶联免疫吸附试验阻断

11(ELISA)………………10

免疫组织化学试验

12(IHC)……………11

综合判定

13………………12

附录规范性样品保存病毒分离与鉴定相关溶液的配制

A()、………13

附录规范性相关溶液的配制

B()PCR、Real-timePCR………………14

附录资料性引物探针信息扩增片段序列及检测结果参照图

C()PCR、Real-timePCR、…………15

附录规范性相关试剂的制备

D()ELISA……………17

附录资料性相关抗原与血清的制备

E()ELISA……………………18

附录规范性相关溶液的配制

F()IHC…………………22

Ⅰ

GB/T21674—2025

前言

本文件按照标准化工作导则第部分标准化文件的结构和起草规则的规定

GB/T1.1—2020《1:》

起草

。

本文件代替猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法猪圆环

GB/T21674—2008《》、GB/T34745—2017《

病毒型病毒实时荧光定量检测方法猪圆环病毒型荧

2SYBRGreenⅠPCR》、GB/T35901—2018《2

光检测方法和猪圆环病毒型阻断抗体检测方法本文件以

PCR》GB/T35910—2018《2ELISA》。

为主整合了的内

GB/T21674—2008,GB/T34745—2017、GB/T35901—2018、GB/T35910—2018

容与相比除结构调整和编辑性改动外主要技术变化如下

,GB/T21674—2008,,:

更改了范围见第章年版的第章

———(1,20081);

删除了实验室生物安全要求见年版的第章

———(20082);

增加了缩略语见第章

———(4);

增加了临床诊断见第章

———(5);

更改了样品采集保存与运输见第章年版的

———、(6,20084.1);

增加了病毒分离与鉴定见第章

———(7);

更改了聚合酶链式反应见第章年版的第章第章第章

———(PCR)(8,20083、4、5);

增加了实时荧光聚合酶链式反应见第章

———(Real-timePCR)(9);

增加了间接酶联免疫吸附试验间接见第章

———(ELISA)(10);

增加了阻断酶联免疫吸附试验阻断见第章

———(ELISA)(11);

增加了免疫组织化学试验见第章

———(IHC)(12);

增加了综合判定见第章

———(13);

增加了样品保存病毒分离与鉴定相关溶液的配制见附录

———、(A);

更改了相关溶液的配制见附录年版的附录

———PCR、Real-timePCR(B,2008A);

增加了相关试剂的制备见附录

———ELISA(D);

增加了相关溶液的配制见附录

———IHC(F)。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别专利的责任

。。

本文件由中华人民共和国农业农村部提出

。

本文件由全国动物卫生标准化技术委员会归口

(SAC/TC181)。

本文件起草单位中国动物卫生与流行病学中心河南农业大学中华人民共和国上海海关南京农

:、、、

业大学湖南农业大学湖南冠牧生物科技有限公司娄底市动物疫病预防控制中心上海市动物疫病预

、、、、

防控制中心河北农业大学湖南派智生物科技有限公司

、、。

本文件主要起草人董雅琴魏战勇张强白娟崔进魏荣王乃东赵和平王先炜房琳琳杨毅

:、、、、、、、、、、、

马世杰李健姜平杨忠苹谭庆辉杨德全张颜郑兰兰袁万哲周文锋谢昊飞

、、、、、、、、、、。

本文件所代替文件的历次版本发布情况为

:

年首次发布

———GB/T21674—2008,2008;

年首次发布

———GB/T34745—2017,2017;

年首次发布

———GB/T35901—2018,2018;

年首次发布

———GB/T35910—2018,2018。

Ⅲ

GB/T21674—2025

引言

猪圆环病毒病又称为猪圆环病毒相关疾病

(Porcinecircovirusdisease,PCVD),(Porcine

是由猪圆环病毒型感染猪

circovirus-associateddisease,PCVAD),2(Porcinecircovirustype2,PCV2)

引起的一系列疾病的总称有不同的临床表现包括猪圆环病毒型系统性疾病

。PCVD,2(PCV2sys-

猪圆环病毒型繁殖性疾病猪皮炎

temicdisease,PCV2-SD)、2(PCV2reproductivedisease,PCV2-RD)、

与肾病综合征及亚临床感染过去称为断奶后

(Porcinedermatitisandnephropathysyndrome,PDNS)。

多系统衰竭综合征的疾病以及引起的

(Postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)PCV2

呼吸道和肠道相关疾病已被证明是的一部分属于圆环病毒科圆环病

PCV2-SD。PCV2(Circoviridae)、

毒属Circovirous单股环状病毒感染猪后可导致免疫抑制易与其他病毒或细菌引起混合感

()DNA,,

染造成猪只生长发育受阻免疫系统受损等与猪繁殖与呼吸综合征病毒

,,。PCV2(Porcine

猪流感病毒副猪

reproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)、(Swineinfluenzavirus,SIV)、

格拉瑟菌猪肺炎支原体等病原的共感染往往会诱发或促进的发生在全球范围内广泛

、PCVD。PCVD

流行各日龄和品种的猪均可发生其中仔猪和母猪受到的危害相对较重该病因其发病率高流行较

,,。、

广易引起免疫抑制等特点给养猪业造成了较重的经济损失在我国现行一二三类动物疫病病种

、,。《、、

名录中该病为三类动物疫病

》,。

本文件诊断技术内容包括临床诊断病原学诊断和血清学诊断结合我国相关技术研究新成果

、,

修订

。

Ⅳ

GB/T21674—2025

猪圆环病毒病诊断技术

1范围

本文件描述了猪圆环病毒病的临床诊断病毒分离与鉴定聚合酶链式反应实时

(PCVD)、、(PCR)、

荧光聚合酶链式反应间接酶联免疫吸附试验间接阻断酶联免疫吸附试验

(Real-timePCR)、(ELISA)、

阻断免疫组织化学试验等方法

(ELISA)、(IHC)。

本文件适用于的诊断检疫检测监测和流行病学调查

PCVD、、、。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款其中注日期的引用文

。,

件仅该日期对应的版本适用于本文件不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于

,;,()

本文件

。

兽医诊断样品采集保存与运输技术规范

NY/T541、

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义

。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件

。

氨基乙基咔唑

AEC:3--9-(3-Amino-9-Ethylcarbazole)

牛血清白蛋白

BSA:(BovineSerumAlbumin)

循环阈值

Ct:(CycleThreshold)

二氨基联苯胺

DAB:(Diaminobenzidine)

二脒基苯基吲哚

DAPI:4',6--2-(4',6-Diamidino-2-Phenylindole)

焦碳酸二乙酯

DEPC:(DiethyPyrocarbonate)

脱氧核糖核酸

DNA:(DeoxyribonucleicAcid)

乙二胺四乙酸

EDTA:(EthyleneDiamineTeraaceticAcid)

酶联免疫吸附试验

ELISA:(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay)

异硫氰酸荧光素

FITC:(FluoresceinIsothiocyanate)

辣根过氧化物酶

HRP:(HorseradishPeroxidase)

间接免疫荧光试验

IFA:(IndirectImmunofluorescenceAssay)

免疫组织化学试验

IHC:(ImmunohistochemicalAssay)

免疫过氧化物酶单层细胞试验

IPMA:(ImmunoperoxidaseMonolayelAssay)

最低限度必需氨基酸营养液

MEM:(MinimumEssentialMedium)

光密度

OD:(OpticalDensity)

磷酸盐缓冲液

PBS:(PhosphateBufferedSaline)

聚合酶链式反应

PCR:(PolymeraseChainReaction)

1

GB/T21674—2025

猪圆环病毒型

PCV2:2(PorcineCircovirusType2)

猪圆环病毒型繁殖性疾病

PCV2-RD:2(PCV2ReproductiveDisease)

猪圆环病毒型系统性疾病

PCV2-SD:2(PCV2SystemicDisease)

猪圆环病毒病

PCVD:(PorcineCircovirusDisease)

猪皮炎与肾病综合征

PDNS:(PorcineDermatitisNephropathySyndrome)

猪肾细胞系

PK-15:(PigKidney-15CellLine)

三羟甲基氨基甲烷乙酸乙二胺四乙酸缓冲液

TAE:--(Tris-aceticAcid-EDTABuffer)

四甲基联苯胺

TMB:3,3',5,5'-(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)

曲拉通聚乙二醇辛基苯基醚

TritonX-100:X-100,(2-(2-[4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)Phenoxy]

Ethoxy)Ethanol)

5临床诊断

51流行病学

.

511猪是天然宿主家猪野猪均是易感动物各种年龄品种的猪均易感

..,、,、。

512传染源主要为病猪临床健康带毒猪

..、。

513主要通过消化道呼吸道等途径传播也可由发病或带毒妊娠母猪通过胎盘感染胎儿

..、,。

52临床症状

.

521猪圆环病毒2型系统性疾病PCV2-SD

..()

病猪表现为生长迟缓消瘦常伴有呼吸困难和腹股沟淋巴结肿大偶发黄疸

、,,。

522猪圆环病毒2型繁殖性疾病PCV2-RD

..()

妊娠母猪出现繁殖障碍主要表现为妊娠早期频繁返情妊娠晚期流产产死胎

,,、。

523猪皮炎与肾病综合征PDNS

..()

病猪皮肤出现以红紫色斑疹和丘疹为特征的出血性和坏死性皮肤病变主要出现在后肢和会阴部

,。

53病理变化

.

531PCV2-SD

..

病变主要见于淋巴组织剖检可见淋巴结肿大胸腺皮质萎缩镜检可见淋巴组织出现中度到重

。,。

度的组织病理变化表现为淋巴结中淋巴细胞减少大量组织细胞和多核巨细胞浸润胸腺中组织细胞

,、,

或树突状细胞可见胞内病毒包涵体

。

532PCV2-RD

..

死胎或不能存活的新生仔猪表现为肝充血和心肌肥大心肌多灶性变色有时可见胎儿心脏明显肥

,,

大镜检可见胎儿心肌损伤表现为大面积纤维素性或坏死性心肌炎

。,。

533PDNS

..

病变主要表现为全身性坏死性血管炎和坏死性纤维素性肾小球肾炎肾脏肿胀苍白皮质大面积

,、,

淤血镜检可见有纤维蛋白和中性粒细胞填充并阻塞间隙伴有非化脓性间质性肾炎

。Bowman’s,。

2

GB/T21674—2025

54结果判定

.

541符合流行病学特征出现临床症状和病理变化可初步判定为疑似病例

..,5.2.15.3.1,PCV2-SD。

确诊应采集疑似发病猪的淋巴结进行第章或第章的病原检测

,712。

542符合流行病学特征出现临床症状和病理变化可初步判定为疑似病例

..,5.2.25.3.2,PCV2-RD。

确诊应采集疑似发病猪流产死胎的心脏淋巴结等组织样品进行第章或第章的病原检测

、,712。

543符合流行病学特征出现临床症状和病理变化可判定为病例

..,5.2.35.3.3,PDNS。

544普遍存在但大多数属于亚临床感染感染的确诊应采集疑似感染猪的血清淋巴

..PCV2,。PCV2、

结流产死胎心脏等样品进行第章第章的核酸或抗体检测

、,8~11PCV2。

6样品采集保存与运输

、

61仪器设备

.

611台式高速冷冻离心机

..。

612组织匀浆机或研磨器

..。

613无菌手术刀剪刀镊子

..、、。

614真空采血管不含抗凝剂无菌注射器

..(EDTA)、。

615无菌离心管样品保存管

..(2mL、15mL)、。

62试剂材料

.

621按照附录中配制

..PBS,AA.1。

622多聚甲醛按照配制

..4%,A.2。

63样品采集

.

631血液样品用真空采血管不含抗凝剂或无菌注射器采集受检猪前腔静脉血不少于

..:(EDTA)

室温凝固后分离血清血清样品可用于病毒分离与鉴定核酸检测和抗体检测

5mL,。、。

632组织样品无菌采集病死猪的淋巴结流产死胎心脏等组织样品至少取组织装入

..:、,5g,15mL

灭菌离心管中编号备用组织样品可用于病毒分离与鉴定和核酸检测

,。、IHC。

64样品保存与运输

.

641采集后无法立即检测的样品可于暂存但不应超过也可冻存于冰

..,2℃~8℃,24h,-20℃

箱长期保存应置于冰箱应尽快采用低温保存方式将样品送达检测实验室按的

,-70℃。,NY/T541

规定执行

。

642用于病毒分离的样品应于内送达检测实验室

..48h。

643用于检测的组织样品应立即浸泡于多聚甲醛中并于内送达检测实验室

..IHC4%,48h。

7病毒分离与鉴定

71仪器设备

.

711生物安全柜

..。

712二氧化碳培养箱

..。

713倒置荧光显微镜

..。

714台式低速离心机

..。

3

GB/T21674—2025

715组织匀浆机或研磨器

..。

716细胞培养瓶

..。

717孔细胞培养板

..96。

718微量可调移液器等不同规格并配备与移

..(0.5μL~10μL、10μL~100μL、100μL~1000μL),

液器匹配的吸头

。

72试剂材料

.

721

..MEM。

722按照配制

..PBS,A.1。

723多聚甲醛按照配制

..4%,A.2。

724细胞生长液按照配制

..,A.3。

725细胞维持液按照配制

..,A.4。

726氨基葡萄糖按照配制

..300mmol/LD-,A.5。

727按照配制

..0.1%TritonX-100,A.6。

728按照配制

..3%BSA,A.7。

729甲醇溶液按照配制

..3%H2O2-,A.8。

7210小鼠抗单克隆抗体

..PCV2。

7211山羊抗小鼠抗体

..FITC-IgG。

7212染色液

..DAPI。

7213山羊抗小鼠抗体

..HRP-IgG。

7214显色试剂盒

..AEC。

7215细胞

..PK-15。

73病毒分离

.

731样品制备组织样品经研磨后按照的比例加入培养基制成的组织悬液反复

..:,1∶9MEM,10%,

冻融次经离心取上清液使用滤膜过滤收集滤出液备用血清样

3,12000r/min15min,,0.22μm,。

品直接使用滤膜过滤收集滤出液备用

0.22μm,。

732细胞制备用胰酶消化处于对数生长期的细胞单层用细胞生长液将细胞稀释为

..:PK-15,PK-15

6个备用

1×10/mL,。

733样品接种将处理过的样品上清液按照的比例接种到新消化的细胞悬液中置于

..:1∶5PK-15,

体积分数二氧化碳培养箱静置培养同时设立不接毒的细胞培养物作为阴性对照

37℃、5%()24h。。

734氨基葡萄糖处理待细胞长至单层时弃掉旧的培养液用清洗次弃净加入适量

..D-:,,PBS2,,

氨基葡萄糖以能完全覆盖细胞单层为准于体积分数二氧化碳培养箱作

300mmol/LD-(),37℃、5%()

用用清洗次弃净

30min;PBS2,。

735病毒培养加入细胞维持液继续培养收集细胞与上清液反复冻融次此为第一代病

..:,48h。,3,

毒培养物

。

736病毒盲传由于接种不出现细胞病变效应应按方法盲传代收获第代

..:PCV2,7.3.2~7.3.55。5

病毒的细胞培养物悬液反复冻融次离心吸取上清液采用或方法

,3,2000r/min20min,,7.4.17.4.2

进行病毒鉴定

。

74病毒鉴定

.

741间接免疫荧光试验IFA

..()

7411消化对数生长期的细胞用细胞生长液稀释成5个孔铺于孔细

...PK-15,1×10/mL,100μL/96

胞培养板

。

4

GB/T21674—2025

7412将待检病毒液接种长至单层的细胞孔同时设置已知病毒接种孔作

...PK-15,100μL/。PCV2

为阳性对照孔设置细胞维持液接种孔作为阴性对照孔

,100μL/;,100μL/。

7413将细胞培养板置于体积分数二氧化碳培养箱中孵育弃去病毒液用清

...37℃、5%()1h,,PBS

洗次次弃净每孔加入细胞维持液继续培养

2,3min/,,100μL,48h。

7414弃上清用冲洗细胞次每孔加入多聚甲醛室温固定弃液

...,PBS3,100μL4%,20min,,

冲洗细胞次每次轻轻拍干

PBS3,3min,。

7415每孔加入室温透膜弃液用冲洗细胞次

...100μL0.1%TritonX-10010min,,PBS3,

次轻轻拍干

3min/,。

7416每孔加入室温封闭弃上清

...100μL3%BSA,1h,。

7417每孔加入小鼠抗单克隆抗体稀释至工作浓度作用弃液用冲

...50μLPCV2(),37℃1h,,PBS

洗细胞次次轻轻拍干

3,3min/,。

7418每孔加入山羊抗小鼠稀释至工作浓度避光反应用冲洗细

...50μLFITC-IgG(),37℃1h,PBS

胞次次轻轻拍干

3,3min/,。

7419每孔加入染色液室温避光反应弃液用冲洗细胞次

...50μLDAPI,5min,,PBS3,3min/

次拍干将孔细胞培养板置于倒置荧光显微镜下观察

,。96。

74110试验成立条件阳性对照细胞出现亮绿色特异性荧光且阴性对照细胞未出现亮绿色特异性

...:,

荧光

。

74111结果判定被检病毒接种的细胞出现亮绿色特异性荧光判定为阳性被检病毒接种的

...:,PCV2;

细胞未出现亮绿色特异性色荧光判定为阴性

,PCV2。

742过氧化物酶单层细胞试验IPMA

..()

7421按操作

...7.4.1.1~7.4.1.5。

7422每孔加入甲醇溶液处理弃液用冲洗细胞次

...100μL3%H2O2-,37℃10min,,PBS3,

次轻轻拍干

3min/,。

7423每孔加入溶液封闭弃上清液

...100μL3%BSA,37℃1h,。

7424每孔加入小鼠抗单克隆抗体稀释至工作浓度作用弃液用冲

...50μLPCV2(),37℃1h,,PBS

洗细胞次次轻轻拍干

3,3min/,。

7425每孔加入山羊抗小鼠稀释至工作浓度孵育用冲洗细胞

...50μLHRP-IgG(),37℃30min,PBS

次每次轻轻拍干

3,3min,。

7426用显色试剂盒显色冲洗细胞次次轻轻拍干将孔细胞培养

...AEC20min,PBS3,3min/,。96

板置于倒置显微镜下观察

。

7427试验成立条件阳性对照细胞呈现特异性红色染色且阴性对照细胞无特异性红色染色

...:,。

7428结果判定被检病毒接种的细胞呈现特异性红色染色判定为阳性被检病毒接种的细

...:,PCV2;

胞无特异性红色染色判定为阴性

,