细胞分子生物学研究方法

一、原位分子杂交技术DNA变性:当溶液中DNA分子处于高温或高pH值(13)条件下,维持双螺旋在一起碱基互补对就被破坏,DNA双链解离成两条单链,这一过程叫DNA变性。DNA复性:当温度降低至适当温度或恢复pH值至中性，两条裂解单链按碱基互补配对标准重新形成双链结构,这一过程叫DNA复性,又叫DNA杂交。第1页第2页第3页

核酸分子杂交：按照碱基互补配对标准，将不一样起源序列互补单链DNA/DNA，RNA/RNA，RNA/DNA，互补配对成双链杂交分子，这一过程叫核酸分子杂交。第4页

原位杂交：用核苷酸探针对特殊核苷酸次序在其原位进行杂交,叫原位杂交。可用于DNA、RNA定位研究。第5页荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）第6页二、聚合酶链反应技术（polymerasechainreaction，PCR）又叫体外基因扩增技术。利用人工合成一对引物，在被扩增DNA模板链两端形成双链，由DNA聚合酶催化一对引物之间聚合反应。第7页详细过程：①变性：将双链DNA加热（95℃）使之变性，DNA双链变成单链②退火：降低温度至56℃使引物与模板DNA单链结合③延伸：将温度升至72℃，在DNA聚合酶作用下，在引物3’端进行延伸，使原模板DNA一条链变成两条链。第8页三、反义技术反义核酸技术主要是引入目标基因mRNA反义序列或与目标基因互补配正确反义基因，经过它们杂交而阻遏或降低目标基因表示一个方法。当引入反义核酸与对应序列互补配对后，用于表示目标基因mRNA量大大降低，使细胞中靶基因编码蛋白合成量也大为降低第9页反义技术应用：①基因功效研究②病毒基因组功效研究③作为药品④抗肿瘤作用第10页四、基因转移技术将外源基因转移到受体菌或细胞内使之在细胞内实现转入基因扩增或表示技术。它是重组DNA、基因功效研究、基因治疗关键技术之一。方式：转化转染第11页转染技术是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞技术，它是研究基因表示调控，突变分析等常规工具。伴随功效研究兴起，其应用越来越广泛。第12页常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，所以一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平表示，但通常只连续几天，多用于开启子和其它调控元件分析。后者也称稳定转染，外源DNA既能够整合到宿主染色体中，也可能作为一个游离体（episome）存在。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要经过一些选择性标识，如来氨丙基转移酶（APH新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等重复筛选，得到稳定转染同源细胞系。第13页影响转染效率主要原因有：

1、细胞培养物

健康细胞培养物是成功转染基础。不一样细胞有不一样培养基，血清和添加物。高转染效率需要一定细胞密度，普通推荐在转染前24小时将细胞传代，这么可提供正常细胞代谢，增加对外源DNA摄入可能。另外一定要防止细菌、支原体或真菌污染。第14页2、血清

大多数培养基在使用前需要加血清。通常血清是一个包含生长因子及其它辅助因子不确切成份添加物，对不一样细胞生长作用有很大差异。血清质量改变直接影响转染效率。所以在转染前提议先测试出对细胞生长良好血清批号，转染时用同一批号血清，并同时做负对照（不加转染试剂及外源DNA）以测试细胞生长是否正常。有些转染技术如脂质体转染在有血清存在情况下效率很低，所以在转染前要除血清。但有些对此敏感细胞如原代细胞会受到损伤，甚至死亡造成转染效率极低。第15页3、载体构建

转染载体构建（病毒载体，质粒DNA、RNA、PCR产物、寡核苷酸等）也影响转染结果。病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不一样病毒载体有其特定宿主，有还要求特定细胞周期，另外还需考虑一些安全问题（如基因污染）。除载体构建外，载体形态及大小对转染效率也有不一样影响，假如基因产物对细胞有毒性作用，转染也极难进行，所以选择组成及适当开启子也很主要，同时做空载体及其它基因相同载体构建正对照可排除毒性影响干扰。第16页4、DNA质量

DNA质量对转染效率影响非常大。普通转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引原理，假如DNA不纯，带少许盐离子、蛋白、代谢物污染都会显著影响转染复合物有效形成及转染进行。核酸纯化世界第一品牌德国QIAGEN企业提供超纯质粒抽提试剂盒使您无须为DNA质量操心。另外，对一些内毒素敏感细胞（如原代细胞，悬浮细胞和造血细胞），QIAGEN还提供可去除内毒素污染质粒抽提试剂盒，在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子，确保理想转染效果。第17页5、转染技术

转染技术选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂百分比，细胞数量，培养及检测时间等。第18页第19页五、基因敲除与敲进

基因敲除（knockoutofgene）：利用基因打靶技术，用无功效外源基因转入细胞与基因组中同源序列进行同源重组，把含有功效同源序列置换出来，造成功效基因缺失或失活，这一技术叫基因敲除。

基因敲进（knockinofgene）