CN119421889A L-组氨酸输出蛋白质及用其生产l-组氨酸的方法 （Cj第一制糖株式会社）

2024.12.23PCT/KR2023/0086572023.06.22WO2023/249422KO2023.12.28L-组氨酸输出蛋白质及用其生产L-组氨酸本申请发现了具有输出L一组氨酸能力的组24.根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述蛋白质与SEQIDNO:48的氨基酸序列具有6.一种微生物，其包含权利要求1至4中任一项所述的所述的蛋白质或编码所述蛋白质的多核苷酸的3[0006]当具有不同种类氨基酸输出能力的蛋白质的表达和/或功能增强时，相应氨基酸[0009]本申请的一个目的是提供一种突变型L一组氨酸输出蛋白质，其中对NO:13的氨基酸序列的第92位残基的氨基酸被另一种氨[0010]本申请的另一个目的是提供一种包含该蛋白质或编码该蛋白质的多核苷酸的微4[0017]在本说明书中，已经证实表达来源于阴道皮肤杆菌(Dermabactervaginalis)的输出活性。含AzlD结构域的蛋白质或AzlC家族ABC转运体渗透酶蛋白质可来源于阴道皮肤质(或DvaE)，来源于阴道皮肤杆菌的AzlC家族ABC转[0023]所述突变型蛋白质可以是其中来源于阴道皮肤杆菌的含野生型AzlD结构域的蛋[0024]来源于阴道皮肤杆菌的含野生型AzlD结构域的蛋白质可包含SEQIDNO:13(WP_5质中SEQIDNO:48的N末端起对应于第92位残基的氨基酸之外的一些氨基酸序列被缺失、[0029]在一个实施方案中，所述突变型蛋白质可能比野生型蛋白质(例如，含有野生型[0030]野生型L组氨酸输出蛋白质可以是与SEQIDNO:12(来源于阴道皮肤杆菌的含野6代表的蛋白质可以由SEQIDNO:15的核酸序列编码，或者SEQIDNO:12和/或SEQIDNO:[0033]编码本申请突变型蛋白质的多核苷酸可以包含编码SEQIDNO:48的氨基酸序列酸或多肽的原始功能和/或所需功能的范围内，对特定的核酸序列或氨基酸序列施加突变核酸序列或氨基酸序列组成”可能意味着所述多核苷酸或多肽(i)基本上包含特定的核酸微生物中优选的密码子，可以在不改变编码区表达的蛋白质的氨基酸序列和/或功能的范Pearson的FASTA算法(参见：MethodsEnzymol.,183,63,1990)来确定。基于这种算法7[0039]多核苷酸或载体的导入可以通过本领域技术人员适当选择已知的转化方法来进核苷酸可以包含编码靶蛋白质的DNA和/或RNA。只要该多核苷酸可以被导入宿主细胞并表用本领域已知的基因重组技术进行，例如，可以通过常见的位点特异性DNA切割和连接进[0040]将多核苷酸转化到宿主细胞中的方法可以通过将核酸导入细胞(微生物)的任何[0041]多核苷酸向宿主细胞基因组(染色体)的导入(插入)可通过本领域技术人员适当8重组载体可用于将多核苷酸插入宿主细胞的基因组中，或取代宿主细胞基因组的相应基[0045]可用于本说明书的载体可以是已知的表达载体和/或用于将多核苷酸插入宿主细码该突变型蛋白质的多核苷酸和包含该多核苷酸的重组载体组成的组中的至少一种的微9何一种或多种的微生物；经修饰以表达本申请突变型蛋白质或本申请多核苷酸的微生物；杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、热产氨棒状杆菌达突变型蛋白质的突变可以通过导入编码上述突变型蛋白质的多核苷酸或包含该多核苷亲本菌株的编码突变型蛋白质的多核苷酸如此可以取代本菌株中编码含AzlD结构域的蛋[0056]在一个实施方案中，当微生物包含突变型蛋白质和野生型AzlC家族ABC转运体渗[0064]导入突变可以包括将编码突变型蛋白质的多核苷酸或包含该多核苷酸的重组载[0066]可用于培养的培养基可以单独使用至少一种或组合使用至少两种选自由糖和碳[0073]其中，考虑到生物安全等级以及确保达到适用于在其中生产菌株的水平的可能[0080]实施例2.导入外源L_组氨酸输出基因候选物的载体及导入相同基因候选物的重[0081]生产了六种载体，用于将实施例1中选出的六种外源L_组氨酸输出基因候选物导的NCgl2131基因用作插入位点(JournalofBiotechnology104,5_25JornKalinowski[0084]为了用输出基因取代NCgl2131基因，生产了NCgl2131缺失和靶基因插入的载为了生产所述载体，以谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13032的染色体为模板，分别使用SEQID的结果，分别获得531bp的del_N2131L(SEQIDNO:22)和555bp的del_N2131R(SEQIDNO:23)的DNA片段。使用QIAGEN公司的PCR纯化试剂盒纯化获得的DNA产物，然后使用pDZ载体[0086]从美国国立卫生研究院GenBank(NIHGenBank)获得编码水草螺菌来源的蛋白质2分钟，重复28次，然后在72℃聚合5分钟的结果，获得包含945bp的haq(SEQIDNO:2)的的引物对，以ATCC13032的染色体为模板进行PCR。作为用于PCR反应的聚合酶，使用409bp的PgapA(SEQIDNO:17)的441bp的PgapA片段。使用Gibson组装(DGGibsonetal.,NATUREMETHODS,VOL.6NO.5,MAY2009,NEBuilderHiFiDNAAssemblyMasterMix)方法[0087]从美国国立卫生研究院GenBank(NIHGenBank)获得编码贪铜菌来源的蛋白质(下贪铜菌来源的cpi，使用SEQIDNO:28和SEQIDNO:29的引物对，以贪铜菌菌株[0088]从美国国立卫生研究院GenBank(NIHGenBank)获得编码栖冷克吕沃尔菌来源的[0089]从美国国立卫生研究院GenBank(NIHGenBank)获得编码停滞棒状杆菌来源的蛋杆菌菌株(ATCC6872)的染色体DNA为模板，进行PCR。作为用于PCR反应的聚合酶，使用717bp的cst(SEQIDNO:8)的749bp的cst片段。为了获得可与cst连接的PgapA片段，使用[0090]从美国国立卫生研究院GenBank(NIHGenBank)获得编码萨尔西修斯亮杆菌来源板进行PCR。作为用于PCR反应的聚合酶，使用PfuUltraTM高可靠性DNA聚合酶[0091]从美国国立卫生研究院GenBank(NIHGenBank)获得编码阴道皮肤杆菌来源的蛋℃聚合5分钟的结果，获得包含409bp的PgapA(SEQIDNO:17)的441bp的PgapA片段。使用Gibson组装方法克隆获得的dva片段和PgapA片段以及用ScaI限制性酶切割的pDZΔN2131缺失载体(pDZΔN2131)以及6种导入外源L_组氨酸输出基因候选物的载体(pDZΔN2131_分别被命名为ATCC13032ΔN2131(N2131基因缺失)、ATCC13032ΔN2131::Haq(用haq取代kcr取代N2131基因)、ATCC13032ΔN2131::Cst(用cst取代N2131基因)、ATCC13032ΔN2131::Lsa(用lsa取代N2131基因)和ATCC13032ΔN2131:[0095]为了证实在上面的实施例2中生产的7种重组谷氨酸棒状杆菌菌株(ATCC13032ΔN2131、ATCC13032ΔN2131::Haq、ATCC13032ΔN2131::Cpi、ATCC13032ΔN2131::Kcr、[0102]导入外源L_组氨酸输出基因候选物的棒状杆菌属菌株在包含L_组氨酸的基本培出候选基因的菌株的生长是不明显的，并且只有导入了阴道皮肤杆菌来源的基因的[0110]由此，选择阴道皮肤杆菌来源的蛋白质Dva作为能够使棒状杆菌菌株对超过最低[0111]实施例4.基于棒状杆菌来源的L一组氨酸生产菌株(KC氨酸输出基因候选物(dva)取代的两种菌株，并分别将其命名为KCCM80179ΔN2131PgapADva菌株在活化培养基中培养16小时，然后将每种菌株接种到含有25mL种子培养基[0125]如上表3所示，证实了NCgl2131缺失菌株具有与亲本菌株KCCM80179菌株相当水于PCR反应的聚合酶，使用PfuUltraTM高可靠性DNA聚合酶(Stratagene)，并且PCR条件如聚合5分钟，获得PgapA片段。使用Gibson组装(DGGibsonetal.,NATUREMETHODS,VOL.6NO.5,MAY2009,NEBuilderHiFiDNAAssemblyMasterMix)方法克隆获得的突变型dva操纵子和PgapA片段以及用ScaI限制性酶切割的pDZΔN2131载体，并转化入DH5α,并提取约10,000个转化的大肠杆菌菌落来提取质粒，并将其命名为pDZΔN2131_PgapA_Dva中以获得约3,300个菌落，每个菌落命名为TCC13032ΔN2131_PgapA_Dva(mt)_1至ATCC13032ΔN2131_PgapA_Dv[0132]葡萄糖10g、蛋白胨10g、牛[0133]对于获得的3,300个菌落，进行实施例3中进行的L_组氨酸的最低抑制浓度(MIC)实验。为了有效筛选，基于包含3gL_组氨酸的液体基本培养基进行。将菌落立即接种到300ul的液体基本培养基中，并在32℃、1000rpm下在96深孔板中培养18小时，然后测量OD600值以选择生长良好的菌落。作为对照组，使用生产的ATCC13032ΔN2131菌株和)2SO4[0139]通过实施例3中进行的方法对选择的78个菌落进行基于固体培养基的筛选，并对[0147]如上面的表4所示，NCgl2131缺失的菌株(ATCC13032ΔN2131)不能在包含1g/L的L_组氨酸的基本培养基中平稳生长，但是其中导入了阴道皮肤杆菌来源的基因的ATCC13032ΔN2131_PgapA_Dva(mt)_2543)的生长水平高于包含1g/L组氨酸的基本培养基[0148]实施例7.导入基于棒状杆菌来源的L_组氨酸生产菌株(KCCM80179)选择的文库[0149]生产用于将实施例6中选择的3种菌落包含的突变型dva导入L_组氨酸生产菌株的(mt)_517、ATCC13032ΔN2131_PgapA_Dva(mt)_1236、ATCC13032ΔN2131_PgapA_Dva将其命名为pDZΔN2131_PgapA_Dva(mt)_517、pDZΔN2131_PgapA_Dva(mt)_1236、pDZΔN2131_PgapA_Dva(mt)_25生产了3种菌株，其中分别导入了3种突变型dva，它们分别被命名为KCCM80179ΔN2131_PgapA_Dva(mt)_517、KCCM80179ΔN2131_PgapA_Dva(mt)_1236、KCCM80179ΔN2131_[0151]为了证实所生产的KCCM80179ΔN2131_PgapA_Dva(mt)_517、KCCM80179Δ80179菌株水平的L_组氨酸生产能力，但是与NCgl2131缺失菌株和亲本菌株KCCM80179菌株相比，其中导入了阴道皮肤杆菌来源的基因的KCCM80179ΔN2131_PgapA_Dva菌株的L_组氨酸生产能力分别增加了23％和21％型dva的3种菌株具有相当于或高于KCCM80179ΔN2131_PgapA_Dva菌株的L_组氨酸生产能[0158]为了证实导入KCCM80179ΔN2131_PgapA_Dva(mt)_2543菌株的Dva中的突变(其位精氨酸(Arg，R)被突变成半胱氨酸(Cys，C))突变被导入到DvaE中，导入KCCM80179ΔN2131_PgapA_Dva(mt)_2543菌株的突变型DvaFE是具有增加的L_组氨酸输出能力的突变型[0164]实施例9.基于L_组氨酸生产菌株(CA14_737)的导入了阴道皮肤杆菌来源的基因[0165]为了证实阴道皮肤杆菌来源的蛋白质Dva突变体的L_组氨酸输出能力，将其导入到来源于野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的L_组氨酸生产菌株CA14_737(KCCM12411P，韩国专利公开号10_2019_0065984)菌株中，在该菌株中导入了HisG多肽突变(其中通过L_[0166]为此，通过电穿孔将实施例2和7中生产的3种载体(pDZΔN2131、pDZΔN2131_N2131_PgapA_Dva(mt)_2543菌株的L_组氨酸生产能力，通过实施例4中进行的方法培养它[0169]导入了CA14_737来源的阴道皮肤杆菌来源的野生型基因和变体的菌株的L_组氨比，其中导入了阴道皮肤杆菌来源的基因的CA14_737ΔN2131_PgapA_Dva菌株的L_组氨酸产量增加了60.0并且CA14_737ΔN2131_PgapA_Dva(mt)_2543菌株(其中导入了突变型[0173]实施例10.用于表达阴道皮肤杆菌来源的野