CN119437853A 单克隆抗体纯化装置及浓度测定方法 （江苏赛孚士生物技术有限公司）

可用于单克隆抗体细胞发酵液上清中单克隆抗脱液中目的单克隆抗体的浓度并计算所述发酵少适用于已有单克隆抗体QX004N、QX005N、QX006N、QX007N、QX008N、QX002N、QX013N和2将所述单克隆抗体细胞发酵液上清上样至所述平衡好的亲测定收集的洗脱液中所述单克隆抗体的浓度，并计算所述洗脱液中单克隆抗体的浓度=A280nm吸光值÷单克隆抗体消单克隆抗体细胞发酵液上清中单克隆抗体的浓度=洗脱液中单克隆抗体的浓度×洗脱所述单克隆抗体为IgG1型单克隆抗体和/或IgG4所述亲和层析介质为ATProteinADiamondPlus亲和所述单克隆抗体细胞发酵液上清为真核细胞发所述第一平衡缓冲液的体积为所述亲和层析介质体积的所述洗脱缓冲液的体积为所述亲和层析介质体积的3包含三个重链互补决定区(CDR_H1、CDR_H2以及CDR_H3)和三个轻链互补决定区(CDR_L1、SLNSYYVGWVRQAPGKGLEWVGVIRIGGGTAYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSRSSINGG所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：8AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIRYDLSWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGIFSFTDDDGLAFGGGTKV4[0002]抗体药物是经细胞培养后生产出的一类蛋白药物，需要纯化是非常关键的一个工艺步骤，该过程利用ProteinA与抗体分子之间可逆的特异性结抗体的产量测定对于工艺前期的细胞株筛选以及确定工艺后的放大生产都有[0003]目前的现有技术，采用高效液相色谱仪结合ProteinA亲和层析柱进行抗体发酵[0009]1.一种用于单克隆抗体细胞发酵液上清中单克隆抗体的分离纯化的简易装置，[0016]所述亲和层析介质优选为ProteinA亲和层析介质，更优选为ATProteinA5DiamondPlus亲和层析柱。所述ATProteinADiamondPlus亲和层析柱可购买于博格隆续模式。所述注射泵例如可以为保定兰格恒流泵有限公司生产的LSP10_1B型10通道注射[0019]2.一种单克隆抗体细胞发酵液上清中单[0027]单克隆抗体细胞发酵液上清中单克隆抗体的浓度=洗脱液中单克隆抗体的浓度×[0028]所述第一平衡缓冲液为20mM的Na2HPO4_NaH2PO4和150mM的NaCl的水溶液，pH为6包含三个重链互补决定区(CDR_H1、CDR_H2以及CDR_H3)和三个轻链互补决定区(CDR_L1、ASGFSLNSYYVGWVRQAPGKGLEWVGVIRIGGGTAYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSRSS[0059]所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：8AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIRYDLSWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGIFSFTDDDGLAFGG7纯化及测定条件对于IgG1型单抗和IgG4型单抗均适用，这大幅减轻了CDMO企业的生产负[0073]如图1所示，本申请提供了一种用于单克隆抗体细胞发酵液上清中单克隆抗体的8[0081]单克隆抗体细胞发酵液上清中单克隆抗体的浓度=洗脱液中单克隆抗体的浓度×[0082]所述第一平衡缓冲液为20mM的Na2HPO4_NaH2PO4和150mM的NaCl的水溶液，pH为[0094]本申请提供了一种利用图1所示的简易装置进行单克隆抗体细胞发酵液上清中单中加入pH调节缓冲液使得洗脱液的pH为6.5～8.0，混匀，调节稀释倍数进行稀释，测定A280nm吸光值，洗脱液中单克隆抗体的浓度=A280nm吸光值÷单克隆抗体消光系数×稀释倍数；单克隆抗体细胞发酵液上清中单克隆抗体的浓度=洗脱液中单克隆抗体的浓度×洗脱缓冲液的体积÷单克隆抗体细胞发酵液上清9层析柱的优点为其配基是基因工程重组的蛋白A片段，在上游构建的时候采用了耐碱的氨[0096]在本申请的一些实施方式中，亲和层析介质可以为ATProteinADiamondPlus的pH为6.5～8.0；例如，加入样品pH调节缓冲液使所述单克隆抗体的洗脱液的pH可以为[0099]在本申请的一些实施方式中，可以在使用第一平衡缓冲液平衡亲和层析介质之[0101]在本申请的一些实施方式中，所述第一平衡缓冲液为20mM的Na2HPO4_NaH2PO4和150mM的NaCl的水溶液，第一平衡缓冲液的pH为6.8，所述第一平衡缓冲[0102]在本申请的一些实施方式中，第二平衡缓冲液为10mM的Na2HPO4_NaH2PO4的水溶[0103]在本申请的一些实施方式中，所述洗脱缓冲液为15mM的枸橼酸和7m[0113]在本申请的一些实施方式中，所述单克隆抗体为IgG1型单克隆抗体和/或IgG4型[0114]在本申请的一些实施方式中，单克隆抗体细胞发酵液上清为真核细胞发酵上清[0128]其中，依次为：CN111718414B专利文献所述的抗人白介素23单克隆抗体QX004N、献所述的抗人干扰素α受体1单克隆抗体QX006N、CN113603775B专利文献所述的人白介素_33单克隆抗体QX007N和CN113683694B专利文献所述的抗人TSLP单克隆抗体QX008N、CN108640991B专利文献所述的抗人白介素17A单克隆抗体QX002N、CN202410059200.8专利23p40亚基全人源单克隆抗体QX00ASGFSLNSYYVGWVRQAPGKGLEWVGVIRIGGGTAYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSRSS[0138]所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO：8AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIRYDLSWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGIFSFTDDDGLAFGG[0140]EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLNSYYVGWVRQAPGKGLEWVGVIRIGGGTAYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSRSSINGGDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL[0142]AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIRYDLSWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGIFSFTDDDGLAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK节稀释倍数进行稀释，测定A280nm吸光值，洗脱液中单克隆抗体的浓度=A280nm吸光值÷单克隆抗体消光系数×稀释倍数；单克隆抗体细胞发酵液上清中单克隆抗体的浓度=洗脱[0146]分别取含有IgG1型单克隆抗体或IgG4型单克隆抗体的细胞发酵液上清各50mL，[0147]各种发酵液上清中单克隆抗体的分离纯化使用如图1所示的简易装置进行。该简层析介质(ATProteinADiamondPlus亲和层析柱)和注射泵(LSP10_1B型10通道注射分别加入pH调节缓冲液使IgG1型单克隆抗体溶液或IgG4型单克隆抗体溶液的pH为6.5~定其中的IgG1型单克隆抗体或IgG4型单克隆抗体浓度：洗脱液中单克隆抗体的浓度=A280nm吸光值÷单克隆抗体消光系数[0158]目的蛋白产量=目的蛋白洗脱缓冲液的蛋白浓度×目的蛋白洗脱缓冲液的体积÷[0162]流动相A（20mmol/LPB+0.15mol/LNaCl称取Na2HPO4.12H2O4.30g，[0166]（2）取上述实施例1中的含有IgG1型单克隆抗体或IgG4型单克隆抗体的发酵液上[0173]分别采用上述1.1的简易测定方法和上述1.2的液相测定方法分别测定了下述单利文献所述的QX001S、CN110746507B专利文献所述的抗人白介素4受体α单克隆抗体QX005N、CN113278071B专利文献所述的抗人干扰素α受体1单克隆抗体QX006N、CN113603775B专利文献所述的人白介素_33单克隆抗体QX007N和CN113683694B专利文献所述的抗人TSLP单克隆抗体QX008N、CN108640991B专利文献所述的抗人白介素17A单克隆抗[0178]表2的测定结果表明，本申请的简易测定方法的测定结果与液相法测定结果的偏抗人IL_17A单克隆抗体，将其命名为HZD_19。经纯化的HZD_19的SDS_PAGE电泳图如图2；HZD_19(Reducing)表示还原条件的HZD_19，HZD_19(non_reducing)表示非还原条件的[0215]EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLNSYYVGWVRQAPGKGLEWVGVIRIGGGTAYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCS[0217]AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIRYDLSWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGIFSFTDDDGLAFGGGT[0220]EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLNSYYVGWVRQAPGKGLEWVGVIRIGGGTAYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSRSSINGGDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS