现代实验动物学技术

现代实验动物学技术试管动物培育技术转基因动物培育技术胚胎工程技术克隆动物培育技术

一、试管动物培育技术

试管动物培育程序

精子卵子

体外受精假母胚胎培养胚胎移植产仔二、转基因动物培育技术转基因动物（transgenicanimal）定义指基因组中整合有外源基因并能表达和稳定遗传的一类动物是借助基因工程技术，将特定的外源基因导入配子、受精卵或早期胚胎细胞，并整合到受体染色体基因组中，外源基因随细胞分裂分配到所有子细胞中，并遗传给后代二、转基因动物培育技术只有当外源基因整合入生殖细胞，才能遗传给子代。嵌合体动物（chimericanimal)只有部分组织细胞的基因组中整合有外源基因逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法制备的动物第一代均为嵌合体雄原核显微注射法制备的动物第一代中1-10％为嵌合体（延迟整合）二、转基因动物培育技术意义探讨基因功能及调控机理建立人类疾病动物模型人类疾病的基因治疗改良、培育动物新品种研制、生产生物活性物质tPA（组织型溶纤蛋白原激活因子）人血红蛋白转基因猪外源基因的表达受特异性有关顺式作用序列作用调控基因表达常是多基因相互作用的结果在某一发育阶段，某一基因的表达可能开始于另一基因的关闭，因而基因表达受到组织特异性和时空的调控只有通过转基因动物才有可能研究基因表达、调控和基因间的相互作用

supermice

二、转基因动物培育技术雄原核显微注射法逆转录病毒感染法胚胎干细胞介导法精子载体导入法二、转基因动物培育技术

逆转录病毒感染法

受精卵四细胞胚囊胚原肠胚

原核注射法胚胎干细胞法

（一）雄原核显微注射法方法借助显微操作仪，将毛细玻璃管针直接插入受精卵的雄原核内，把纯化的目的基因（DNA）注入其中，再移植到受体进一步发育。步骤取卵目的基因的制备显微注射

卵移植目的基因的检测建系（一）雄原核显微注射法优点实验过程简化任何DNA可直接导入原核内，且长度可达50kb大多数情况下，外源DNA在卵裂前与受体基因组整合，可分布在所有组织细胞中（一）雄原核显微注射法缺点设备昂贵,技术要求高对卵子损伤大，胚胎存活率低有些动物的原核看不清楚，需经特殊处理才能有效导入基因整合的随机性（引起宿主基因序列重排、缺失、重复、异位，或不插入，呈游离状态，以质粒形式存在）外源基因常以多拷贝串联形式整合，导致该区域异染色质化，使转基因沉默（一）雄原核显微注射法注意情况整合拷贝数1-100左右，多拷贝常以首尾相联的形式存在，建系过程中随代数增加，拷贝数降低整合位点单一整合是随机的基因表达强弱不一定与拷贝数正相关，可能与位置效应有关（二）逆转录病毒感染法方法以逆转录病毒作载体，把外源目的基因克隆到载体中，将此重组DNA利用包装细胞包装成高感染滴度的病毒颗粒，用共培养法感染发育早期的胚胎，将外源基因导入宿主染色体内。（二）逆转录病毒感染法优点无需昂贵设备避免注射法对卵子造成的伤害宿主范围广可同时感染大量胚胎，感染率高，胚胎存活率高常为单拷贝整合（二）逆转录病毒感染法缺点病毒载体容量不大，导入外源基因大小受限，为10-15kb整合位点随机，整合率不高受体为多次卵裂后的早期胚胎，使外源基因在动物组织分布不均，不易整合到生殖细胞重组逆转录病毒不稳定，外源基因易重排或丢失病毒DNA序列可能会干扰外源基因的表达，其长末端重复序列（LTR具转录启动子活性）的甲基化状态常使导入基因的表达缺如逆转录病毒的致癌性某些胚胎的自我保护机制对逆转录病毒入侵的有抗性比较（三）胚胎干细胞介导法胚胎干细胞（embryonicstemcell,ES)是从囊胚期胚胎的内细胞团分离出来的一种高度未分化具多向发育潜能的细胞即可进行体外培养，又可与早期胚胎聚集，参与宿主胚胎的发育（三）胚胎干细胞介导法方法分离培养ES细胞，体外导入外源基因，再移入同期胚胎成嵌合胚胎，发育成嵌合体动物在ES细胞上的基因操作：可通过逆转录病毒感染、脂质体介导、电穿孔、磷酸钙共沉淀等方法将外源目的基因导入ES细胞（三）胚胎干细胞介导法囊胚腔注射法步骤分离培养ES细胞ES细胞基因操作囊胚期胚胎移植囊胚腔注射嵌合胚嵌合体动物（三）胚胎干细胞介导法优点外源基因整合情况的可控性高。可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞的鉴定和筛选方便（三）胚胎干细胞介导法缺点ES细胞系建立及培养困难维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易所得个体为嵌合体（四）精子载体导入法方法将外源目的基因导入精子，利用精子与卵子受精的过程将外源基因导入胚胎优点方法简单缺点载入及整合效率不稳定（五）转基因动物培育的新方法与核移植技术相结合用转染有外源目的基因的供体体细胞通过核移植进行动物克隆转染MⅡ卵母细胞受精前将带有外源目的基因的逆转录病毒载体显微注射入减数分裂中期的卵母细胞（五）转基因动物培育的新方法人工酵母染色体（YAC）载体法保证巨大基因的完整性和高整合率鉴于基因的完整性，目的基因的上下游侧翼序列可以消除或减弱基因整合后的位置效应保证所有顺势基因的完整，并与结构基因的位置不变。二、转基因动物培育技术存在问题制作转基因动物效率低转基因表达不理想转基因可能对宿主产生各种不利影响三、胚胎工程技术胚胎分割胚胎嵌合胚胎干细胞单亲纯合二倍体动物四、克隆动物培育技术克隆（clone）定义广义指一个遗传单位，通过无性繁殖方式产生生物学上完全相同的遗传单位基因扩增细胞分裂核移植克隆动物

指用人工方法经无性繁殖得到的在遗传上与亲本动物完全相同的动物四、克隆动物培育技术胚胎分割法单亲纯合二倍体法核移植法将供体细胞核移入去核的卵母细胞中，使其不经过有性过程即可被激活、分裂并发育成为与核供体在遗传上完全相同的个体供体细胞包括胚胎细胞、干细胞、体细胞核移植法原理胚胎的每一个卵裂球或机体的每个细胞都具有相同的遗传物质已发生早期分化的胚胎细胞及处于终末分化状态的体细胞，将其核移入成熟卵母细胞中，可因其中特殊因子的作用，移入的核基因表达被重排、调整，发育钟被拨回到零点状态，即恢复全能性核移植法操作过程卵母细胞移去细胞核供体细胞核激活

换核的卵细胞桑椹胚、囊胚移植四、克隆动物培育技术科学意义打破了动物体细胞无全能性的传统定论，为发育生物学、遗传学等学科的发