生物制品效价测定指南（试行）

生物制品效价测定指南（试行）本指南适用于疫苗、抗毒素/抗血清、重组蛋白药物、单克隆抗体药物、血液制品、细胞治疗产品、基因治疗产品等各类生物制品的体内外效价测定工作，可用于产品研发阶段活性评价、工艺验证、稳定性考察、上市放行、上市后抽验等全生命周期的效价质量管控。本指南为指导性文件，未尽事宜参照《中华人民共和国药典》三部、国家药品监督管理局发布的相关技术指导原则执行，若遇法定标准更新，以最新生效版本为准。1术语与定义1.1效价：指生物制品发挥特定生物学功能的活性强度，通常以国际单位（IU）、活性单位（U）、蚀斑形成单位（PFU）、半数感染量（TCID50/CCID50）等法定单位表示，分为绝对效价与相对效价两类。1.2相对效价：指相同试验条件下，供试品活性与经溯源标定的参考品活性的比值乘以参考品标示效价，是生物制品效价测定的主流表示方式。1.3法定参考品：指由中国食品药品检定研究院或世界卫生组织发放的，经标定赋值、可溯源的活性参考物质，分为一级参考品（国家/国际参考品）和二级工作参考品，工作参考品需溯源至一级参考品，每6个月复标1次。1.4可信限率：指效价测定结果的95%可信区间上下限差值与效价均值的比值，是反映测定结果可靠性的核心指标。2基本要求2.1人员要求2.1.1操作人员需完成生物安全操作规范、对应品类效价测定原理、操作流程、数据分析方法的系统培训，经理论+实操考核合格后方可上岗。2.1.2涉及动物试验的操作人员需持有《实验动物从业人员资格证》，涉及高致病性微生物操作的人员需经对应等级生物安全操作培训并备案。2.1.3效价测定结果需经授权的质量控制人员复核签字后方可生效，授权人员需具备3年以上生物制品质量控制工作经验。2.2物料要求2.2.1参考品需严格按照说明书要求储存，不得超效期使用，工作参考品需建立标定、复标、报废台账，确保溯源链完整。2.2.2试验用试剂、培养基、缓冲液需符合中国药典三部要求，每批次试剂需经适用性验证：细胞培养基需支持目标细胞的贴壁/悬浮生长，存活率≥95%，pH值波动≤±0.2，微生物限度符合要求；试剂需标注批号、效期、配制人、储存条件，储存时间不得超过规定期限，比如无血清细胞培养基2-8℃储存不超过1个月，PBS缓冲液室温储存不超过7天。2.2.3试验用动物需符合《实验动物微生物学等级及监测》（GB14922）要求，小鼠、豚鼠等小型实验动物需采用SPF级，遗传背景明确，体重差异≤±10%，健康无外伤，试验前适应性饲养至少3天。2.3环境与设备要求2.3.1体外效价测定实验室需符合《检测和校准实验室能力的通用要求》（GB/T27025）要求，微生物相关试验需在对应等级的生物安全柜内开展，无菌操作区洁净度为A级，背景洁净度为B级，悬浮粒子数、沉降菌数符合GB50591要求。2.3.2细胞培养用CO2培养箱需每日记录温度、CO2浓度，温度控制在37℃±0.5℃，CO2浓度控制在5%±0.2%，每月做一次微生物污染监测，无支原体、细菌、真菌污染。2.3.3计量设备需定期检定校准：移液器的计量误差要求为≤10μL量程误差≤±2%，10-100μL量程误差≤±1%，≥100μL量程误差≤±0.5%，每3个月校准1次；酶标仪吸光度准确度≤±0.01A，波长准确度≤±2nm，每6个月校准1次；离心机转速误差≤±5%，温度误差≤±1℃，每年校准1次；生物安全柜气流速度控制在0.38-0.5m/s，每12个月校准1次。2.3.4体内试验动物房需符合《实验动物环境及设施》（GB14925）要求，SPF级动物房温度控制在20-26℃，相对湿度40%-70%，换气次数15-20次/h，明暗交替周期12h/12h，氨浓度≤14mg/m³。3通用测定程序3.1试验设计所有效价测定需采用平行对照设计，供试品与参考品在完全相同的时间、环境、操作条件下开展测定，同时设置三类对照：空白对照（仅加入稀释液，无活性物质）、阴性对照（无活性的同基质样品，排除基质干扰）、阳性对照（已赋值的质控样品，验证试验体系有效性）。每次独立试验的剂量梯度不少于3个，剂量间隔采用等比梯度（通常为2倍或3倍稀释），剂量-反应曲线需符合对数线性关系，线性相关系数r≥0.95，体内试验的每组动物数不少于10只，体外试验的每个剂量组不少于3个复孔，所有试验需至少开展3次独立重复，取几何平均值作为最终结果。3.2样品制备3.2.1试验前需核查供试品、参考品的性状，无变色、浑浊、沉淀、破瓶、漏液等异常，存储条件符合要求，未超效期。3.2.2按照产品说明书要求进行复溶、稀释，冻干样品复溶时需沿瓶壁缓慢加入稀释液，避免产生气泡，静置10-15min确保完全溶解，不得剧烈涡旋导致蛋白变性或病毒裂解。稀释过程需逐级稀释，避免一步稀释导致的误差，每级稀释后需轻柔混匀，更换枪头避免交叉污染。3.2.3稀释后的样品需在规定时限内完成测定：活病毒疫苗稀释后室温放置不超过2h，2-8℃放置不超过4h；重组蛋白、抗体样品稀释后2-8℃放置不超过24h；细胞治疗产品制备后需在2h内完成效价测定。3.3操作过程3.3.1加样需按照空白对照、阴性对照、参考品、供试品、阳性对照的顺序开展，每更换一个样品更换一次枪头，加样时避免枪头接触孔壁/管壁，加样误差≤±5%。3.3.2细胞试验的接种细胞需处于对数生长期，存活率≥90%，接种密度符合产品要求，比如贴壁细胞接种后24h汇合度达到70%-80%，悬浮细胞接种密度为1×10^5-5×10^5个/mL。3.3.3体内试验的给药剂量按照动物体重计算，给药途径符合产品要求（肌肉、腹腔、静脉、皮下等），每只动物的给药体积误差≤±5%，给药后按照要求观察记录动物的发病、死亡、体重变化等情况，观察期内死亡动物需做尸检明确死亡原因。3.4终点判定3.4.1体外试验的终点判定需采用统一标准，比如细胞病变效价判定为50%细胞出现典型病变的稀释度，ELISA效价判定为吸光度值是阴性对照2.1倍的最高稀释度，杀伤试验判定为效靶比10:1时的靶细胞死亡率。3.4.2所有读数需双人复核，涉及主观判定的结果（如细胞病变、动物发病情况）需由2名经验丰富的人员独立判定，判定结果一致方可生效，差异≥1个稀释度的需重新判定或重复试验。4分类产品特异性测定要求4.1疫苗类产品4.1.1灭活疫苗：常规采用动物攻毒保护法或抗原定量ELISA法测定效价，比如狂犬病灭活疫苗采用NIH法，SPF级小鼠体重10-12g，每组10只，免疫2次间隔7天，免疫后14天脑腔攻击100LD50的狂犬病固定毒，观察14天，计算半数有效量（ED50），相对效价≥2.5IU/剂为合格；新冠灭活疫苗采用抗原含量ELISA法，S蛋白含量≥10μg/剂为合格。4.1.2减毒活疫苗：采用蚀斑形成单位（PFU）或半数细胞感染量（CCID50）测定效价，比如麻疹减毒活疫苗每剂≥3.3lgCCID50，水痘减毒活疫苗每剂≥3.4lgPFU。PFU测定操作要求：接种2×10^5个/mL的易感细胞，待细胞汇合度达到80%时接种10倍梯度稀释的病毒液，37℃吸附1h后加入覆盖层，培养5-7天后染色计数蚀斑，计算PFU值。CCID50采用Reed-Muench法计算，每组8个复孔，培养7天后判定细胞病变，计算lgCCID50值。4.1.3重组亚单位疫苗：采用假病毒中和试验或抗原结合ELISA测定效价，比如HPV疫苗的相对结合活性在参考品的70%-130%之间为合格，新冠重组蛋白疫苗的假病毒中和IC50不低于参考品的50%为合格。4.2血液制品4.2.1免疫球蛋白类：破伤风人免疫球蛋白采用小鼠中和试验测定效价，每克蛋白≥100IU；静注人免疫球蛋白的Fc段活性采用补体结合试验测定，活性≥80%，IgG纯度≥95%。4.2.2凝血因子类：人凝血因子Ⅷ采用一期凝固法测定效价，每瓶效价≥标示量的80%；人纤维蛋白原的效价采用凝固时间法测定，每克蛋白≥0.5g纤维蛋白。4.3抗毒素与抗血清采用动物毒素中和试验测定效价，比如白喉抗毒素每毫升≥2000IU，破伤风抗毒素每毫升≥3000IU，效价测定的可信限率≤20%。4.4重组蛋白与单抗药物4.4.1细胞因子类：重组人干扰素采用WISH细胞/VSV病毒的细胞病变抑制法测定效价，相对效价在标示量的80%-120%之间为合格；重组人促红素采用小鼠网织红细胞计数法测定效价，给药后4天网织红细胞比例较对照组升高≥2倍，相对效价在标示量的80%-125%之间为合格。4.4.2单克隆抗体类：抗PD-1单抗采用结合活性ELISA法测定，相对结合活性在标示量的70%-130%之间为合格；抗肿瘤单抗采用补体依赖的细胞毒性（CDC）或抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（ADCC）试验测定，杀伤率≥40%为合格。4.5细胞与基因治疗产品4.5.1CAR-T细胞产品：效价测定包含CAR阳性表达率、靶细胞杀伤率、细胞因子释放量三项指标，CAR阳性表达率≥30%，效靶比10:1时靶细胞杀伤率≥40%，IFN-γ释放量为阴性对照的5倍以上为合格。4.5.2溶瘤病毒产品：采用TCID50或PFU测定病毒滴度，每剂≥1×10^7PFU，同时采用肿瘤细胞杀伤试验测定活性，效靶比1:1时杀伤率≥30%为合格。5方法学验证要求5.1专属性：需验证测定体系仅对目标活性物质有响应，无基质、杂质、辅料的干扰，加样回收率在90%-110%之间，空白对照、阴性对照的响应值≤总响应值的1%。5.2线性：剂量-反应的对数线性范围需覆盖产品标示量的50%-150%，线性相关系数r≥0.95，体内试验可放宽至r≥0.9。5.3精密度：日内精密度为同一样品同一天内测定6次的相对标准偏差（RSD），体外试验RSD≤10%，体内试验RSD≤20%；日间精密度为同一样品连续3天、每天测定3次的RSD，体外试验RSD≤15%，体内试验RSD≤25%。5.4准确度：采用回收率法验证，分别配制标示量80%、100%、120%三个浓度的供试品，每个浓度重复3次，回收率需在90%-110%之间，RSD≤10%，体内试验回收率可放宽至85%-115%。5.5耐用性：考察操作参数轻微波动对结果的影响，包括缓冲液pH±0.2、培养温度±1℃、孵育时间±10%、稀释倍数±5%，不同操作人员、不同批次试剂的测定结果RSD≤15%，证明方法耐用性良好。5.6检出限与定量限：检出限为可区分于空白对照的最低活性浓度，定量限为回收率在80%-120%之间、RSD≤20%的最低活性浓度，需低于产品质量标准限度的50%，确保可准确测定不合格样品。6结果计算与判定6.1计算方法6.1.1相对效价采用平行线分析法计算，首先开展平行性检验，供试品与参考品的剂量-反应曲线斜率差异无统计学意义（P≥0.05）方可判定为平行，按照中国药典三部生物检定统计法计算效价均值及95%可信区间，可信限率≤20%（体内试验≤30%）的结果为有效结果。6.1.2绝对效价计算：PFU/mL=（平均蚀斑数×稀释倍数）/接种体积；TCID50采用Reed-Muench法计算：lgCCID50=高于50%病变的最高稀释度对数+距离比例×稀释倍数对数，距离比例=（高于50%的病变率-50%）/（高于50%的病变率-低于50%的病变率）。6.2有效性判定试验需同时满足以下条件方可判定为有效：参考品测定值在其标示量的90%-110%之间；空白对照、阴性对照符合预期（如细胞试验阴性对照细胞存活率≥95%，动物试验阴性对照死亡率为100%）；阳性对照（质控样）测定值在其标示值的±2SD范围内。6.3合格判定供试品效价结果符合法定质量标准或企业注册标准的判定为合格，低于标准限度的判定为不合格；若结果处于标准限度的±5%临界范围内，需重复2次独立试验，取3次结果的几何平均值判定，仍低于标准的判定为不合格。7质量控制与偏差处理7.1内部质量控制每批次效价测定需随样测定室内质控样，质控样测定值处于其均值的±2SD范围内为试验受控，超出±2SD需预警，超出±3SD需判定试验无效。每月统计室内质控的变异系数（CV），CV≤15%为受控状态，超出的需开展原因分析。7.2外部质量评价每年至少参加1次由中国食品药品检定研究院或国际权威机构组织的效价测定能力验证活动，结果需为满意；若结果不满意，需在15天内完成偏差调查，采取纠正预防措施，重新参加能力验证合格后方可继续开展测定工作。7.3偏差处理7.3.1出现以下情况需立即启动偏差调查：参考品测定值超出90%-110%范围、平行性检验不合格、可信限率超标、质控样超出±2SD、平行样RSD≥20%。7.3.2偏差调查需在24小时内启动，核查样品储存记录、试剂批号、设备校准记录、操作过程记录、环境参数记录，明确偏差原因。若为偶然误差（如加样错误、稀释错误），可重新开展试验；若为系统误差（如设备失准、参考品降解、试剂不合格），需立即停止相关测定工作，采取校准设备、更换参考品/试剂、重新培训人员等纠正措施，对近3个月的测定结果进行回顾评估，确认无不合格产品放行后方可恢复工作。7.3.3纠正预防措施需进行有效性验证，连续开展3批试验，结果均符合要求方可判定措施有效。8生物安全与记录管理8.1生物安全要求涉及高致病性微生物的效价测定需在对应等级的生物安全实验室开展，操作人员穿戴符合要求的个人防护装备，试验产生的固体废弃物采用1