生物制品重金属测定指南（试行）

生物制品重金属测定指南（试行）1适用范围本指南适用于疫苗、血液制品、重组蛋白药物、单克隆抗体药物、细胞治疗产品、基因治疗产品、益生菌类生物制品、抗毒素及抗血清等各类生物制品中铅（Pb）、镉（Cd）、砷（As）、汞（Hg）、铜（Cu）、铬（Cr）、镍（Ni）7种常见有害重金属及类金属元素的定量测定。本指南规定的方法检出限可满足各类型生物制品的限量管控要求，若产品各论中有特殊检测需求的，可结合方法学验证调整检测参数。2规范性引用文件《中华人民共和国药典》2025年版三部、GB2762-2022食品安全国家标准食品中污染物限量、GB/T27417-2017合格评定化学分析方法确认和验证指南、ICHQ3D（R1）元素杂质指导原则、GB/T602化学试剂杂质测定用标准溶液的制备、WS233病原微生物实验室生物安全通用准则。3术语和定义3.1生物制品基质：指生物制品中除待测重金属元素外的所有组分，包括活性成分、佐剂、稳定剂、赋形剂、缓冲盐等。3.2有害重金属：本指南所指重金属为对人体具有明确毒性、需严格管控的金属及类金属元素，不包括临床治疗所需的金属类活性成分。3.3检出限（LOD）：指特定检测方法下，能够定性检出待测元素的最低浓度，对应3倍空白样品测定值的标准偏差。3.4定量限（LOQ）：指特定检测方法下，能够准确定量待测元素的最低浓度，对应10倍空白样品测定值的标准偏差，且定量限浓度下加标回收率需满足80%-120%、相对标准偏差（RSD）≤10%的要求。3.5基质效应：指样品基质组分对待测元素测定信号的增强或抑制作用，基质因子在0.8-1.2范围内判定为基质效应可接受。4人员要求4.1操作人员需经过重金属检测专项技术培训，掌握样品前处理、仪器操作、数据处理等相关技能，考核合格后方可上岗。4.2处理感染性生物制品（如活疫苗、病原类生物制品等）的人员，需经过生物安全培训，掌握病原灭活、个人防护、废弃物处理等操作规范，符合WS233的相关要求。4.3检测人员需熟悉生物制品的质量管控要求，能够独立判断检测数据的合理性，异常情况可按规范开展排查。5仪器设备与耗材5.1前处理设备5.1.1微波消解仪：配备程序温控系统，温控精度±2℃，最高工作温度≥220℃，最高工作压力≥150bar，带超压自动泄压保护装置。5.1.2赶酸仪：温控范围室温-200℃，温控精度±5℃，适配微波消解管，孔间温差≤5℃。5.1.3分析天平：分度值0.1mg，精度等级Ⅰ级，每年经计量检定合格。5.1.4超纯水仪：出水电阻率≥18.2MΩ·cm（25℃），总有机碳（TOC）≤10μg/L，重金属含量低于方法检出限的1/10。5.1.5Ⅱ级生物安全柜：用于感染性样品的取样、灭活操作，洁净度等级A级，每年经性能验证合格。5.1.6其他：涡旋振荡器（转速≥3000rpm）、高速离心机（最高转速≥12000rpm）、马弗炉（最高温度≥1000℃）、压力消解罐（聚四氟乙烯内衬，最高耐受温度≥180℃）。5.2检测设备5.2.1电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）：质量数扫描范围5-250amu，灵敏度要求：1μg/L115In信号强度≥200000cps，氧化物产率（CeO+/Ce+）<2%，双电荷产率（Ce2+/Ce+）<3%，配备碰撞反应池系统，可消除多原子离子干扰，每年经计量检定合格。5.2.2石墨炉原子吸收分光光度计（GFAAS）：配备氘灯或塞曼背景校正系统，镉元素检出限≤0.02μg/L，铅元素检出限≤0.1μg/L，每年经计量检定合格。5.2.3原子荧光光度计（AFS）：砷元素检出限≤0.01μg/L，汞元素检出限≤0.001μg/L，配备氢化物发生系统，每年经计量检定合格。5.2.4火焰原子吸收分光光度计（FAAS）：铜元素检出限≤0.01mg/L，适合高含量铜、镍元素的快速测定，每年经计量检定合格。5.3耗材与试剂5.3.1所有接触样品、试剂的容器均为无金属残留级聚丙烯（PP）或聚四氟乙烯（PTFE）材质，禁止使用玻璃容器，避免重金属溶出干扰。新耗材使用前需经20%（v/v）电子级硝酸浸泡24h以上，用超纯水冲洗6次后，于无尘环境中烘干密封保存。5.3.2试剂：硝酸（电子级，金属杂质含量≤0.1μg/L）、过氧化氢（优级纯及以上，金属杂质含量≤0.1μg/L）、氢氟酸（电子级，用于含铝佐剂、硅基赋形剂的样品消解）、硫脲（优级纯）、抗坏血酸（优级纯）、硼氢化钾（优级纯）、磷酸二氢铵（优级纯）、硝酸镁（优级纯）、金标准溶液（1000mg/L，用于汞元素测定的稳定剂，最终浓度0.05mg/L）。每批试剂采购后需进行空白验收，试剂空白中待测元素含量低于方法检出限的1/3方可使用。5.3.3标准物质：待测元素标准溶液为有证标准物质，扩展不确定度≤2%（k=2），符合GB/T602的要求；内标元素标准溶液（钪Sc、锗Ge、铟In、铋Bi）为有证标准物质，纯度≥99.99%；质控样品为国家认可的有证生物制品基质标准物质，或经实验室均匀性、稳定性验证的内部质控样。6样品采集与保存6.1采样器具采用无金属污染的PP或PTFE材质，每批样品至少采集3个独立包装单元，总取样量不少于10g（固体制剂）或10mL（液体制剂），采样过程避免接触金属器具，防止外源污染。6.2感染性样品采样后需在生物安全柜中密封包装，标注生物安全警示标识，按照规定的温度运输至实验室。6.3样品需按产品说明书规定的储存条件存放，冻干制剂需在检测前用无重金属污染的超纯水复溶，复溶过程严格按照产品各论要求操作。6.4样品采集后7天内完成前处理，消解后的待测液于4℃避光保存，汞、砷元素待测液需加入0.05%重铬酸钾或0.05mg/L金溶液作为稳定剂，72h内完成检测。7样品前处理根据样品基质类型、待测元素种类选择合适的前处理方法，所有前处理操作需在无尘通风橱中进行，避免环境灰尘污染。7.1微波消解法（通用方法，适用于所有基质、所有待测元素）7.1.1样品称量：准确称取固体制剂0.2-1g（精确至0.0001g）或准确移取液体制剂0.5-2mL（精确至0.001mL）至消解管中。感染性样品先进行灭活处理：活疫苗类样品采用60℃水浴加热30min，病原类制品按药典规定的灭活方法处理，灭活后取样验证无感染性后方可进行后续操作。7.1.2预消解：向消解管中加入5mL电子级硝酸，轻轻摇匀后静置1-2h进行预消解，含高浓度蛋白（≥20mg/mL）、高佐剂含量的样品预消解时间延长至4h，避免消解过程中压力骤升导致爆罐。待无明显气泡产生后，加入2mL过氧化氢，含铝佐剂的样品额外加入1mL氢氟酸，轻轻摇匀后密封消解管。7.1.3消解程序：采用梯度升温程序：第一阶段10min升温至120℃，保持5min；第二阶段5min升温至160℃，保持5min；第三阶段5min升温至200℃，保持20min；消解完成后自然冷却至60℃以下，取出消解管。7.1.4赶酸与定容：将消解管置于赶酸仪上，140℃赶酸至消解液剩余0.5-1mL，若加入氢氟酸的样品需赶至近干后，加2mL硝酸再次赶酸1次，去除残留氢氟酸。冷却后用2%（v/v）硝酸将消解液转移至10mLPP容量瓶中定容至刻度，涡旋混匀待测。7.1.5空白试验：每批样品同步做2份试剂空白，除不加样品外，其余操作与样品完全一致。7.2直接稀释法（适用于基质简单的重组蛋白、多肽类生物制品，蛋白浓度≤10mg/mL，不含佐剂、高浓度盐类）准确移取0.1-1mL样品，用含0.1%（v/v）硝酸、0.1%（v/v）曲拉通X-100的稀释液稀释10-50倍，涡旋混匀后直接进样测定。该方法使用前需开展基质加标回收验证，回收率符合要求方可使用。7.3干法灰化法（适用于不含挥发性待测元素（汞、砷）的血液制品、多糖类生物制品）准确称取1g样品至石英坩埚中，置于可调温电炉上小火碳化至无烟产生，转移至马弗炉中550℃灰化4h，冷却后取出，加2mL硝酸溶解灰分，转移至赶酸仪140℃赶酸至近干，用2%硝酸定容至10mL待测。7.4压力罐消解法（适用于无微波消解仪的实验室，不适用于汞元素测定）样品称量、预消解操作同微波消解法，将消解管置于压力消解罐中密封，置于烘箱中150℃消解4h，冷却后赶酸定容，操作同7.1.4。8检测方法8.1ICP-MS法（首选方法，可同时测定7种元素）8.1.1仪器调谐：采用1μg/L的锂、钴、铱、铈、铀混合调谐液对仪器进行调谐，调整透镜电压、等离子体功率、载气流量等参数，满足灵敏度、氧化物产率、双电荷产率的性能要求，碰撞反应池模式下氦气流量设置为4.0-4.5mL/min，消除多原子离子干扰。8.1.2同位素选择：铅选择208Pb，镉选择111Cd，砷选择75As，汞选择202Hg，铜选择63Cu，铬选择52Cr，镍选择60Ni，内标元素选择：质量数<80的Cr、Ni、Cu、As采用72Ge或45Sc作为内标，质量数80-200的Cd采用115In作为内标，质量数>200的Pb、Hg采用209Bi作为内标，内标最终浓度为10μg/L，采用在线加入方式添加。8.1.3标准曲线配制：用2%硝酸配制系列标准工作液，浓度范围：Cr、Ni、Cu、Pb为0.1-50μg/L，Cd为0.05-20μg/L，As为0.5-50μg/L，Hg为0.05-10μg/L，汞元素标准溶液中需加入0.05mg/L金溶液作为稳定剂。8.1.4样品测定：先测定试剂空白，再测定标准曲线，标准曲线相关系数需≥0.999。之后依次测定样品，每测定10个样品，加测1次中间浓度标准点和1份试剂空白，中间浓度点偏差需≤10%，空白值需低于检出限，否则重新绘制标准曲线。8.2石墨炉原子吸收法（适用于无ICP-MS的实验室，单元素测定Pb、Cd）8.2.1Pb测定：检测波长283.3nm，灯电流5mA，狭缝宽度0.5nm，基体改进剂为0.1%磷酸二氢铵+0.06%硝酸镁，进样量20μL。升温程序：干燥120℃保持20s，灰化700℃保持10s，原子化1800℃保持3s，净化2400℃保持3s。标准曲线范围1-50μg/L，相关系数≥0.995，检出限≤0.1μg/L。8.2.2Cd测定：检测波长228.8nm，灯电流4mA，狭缝宽度0.5nm，基体改进剂同Pb。升温程序：干燥120℃保持20s，灰化500℃保持10s，原子化1500℃保持3s，净化2200℃保持3s。标准曲线范围0.1-10μg/L，相关系数≥0.995，检出限≤0.02μg/L。8.3原子荧光光度法（适用于As、Hg的专项测定）8.3.1As测定：载流为5%（v/v）盐酸，还原剂为2%（m/v）硼氢化钾+0.5%（m/v）氢氧化钾。样品预还原：取2mL消解液，加入1mL10%（m/v）硫脲+10%（m/v）抗坏血酸混合液，室温放置30min，将五价砷完全还原为三价砷。检测参数：负高压280V，灯电流60mA，载气流量400mL/min，屏蔽气流量800mL/min。标准曲线范围0.5-20μg/L，相关系数≥0.999，检出限≤0.01μg/L。8.3.2Hg测定：载流为5%（v/v）硝酸，还原剂为0.05%（m/v）硼氢化钾+0.2%（m/v）氢氧化钾，标准溶液和样品中加入0.05mg/L金溶液作为稳定剂。检测参数：负高压260V，灯电流30mA，载气流量300mL/min，屏蔽气流量800mL/min。标准曲线范围0.05-10μg/L，相关系数≥0.999，检出限≤0.001μg/L。8.4火焰原子吸收法（适用于Cu、Ni含量≥0.1mg/kg的样品测定）Cu检测波长324.7nm，灯电流3mA，狭缝宽度0.5nm，空气流量6L/min，乙炔流量1.2L/min，标准曲线范围0.05-5mg/L，相关系数≥0.995，检出限≤0.01mg/L；Ni检测波长232.0nm，灯电流4mA，狭缝宽度0.2nm，标准曲线范围0.1-10mg/L，相关系数≥0.995，检出限≤0.02mg/L。9方法学验证新方法启用、基质更换、仪器重大维修或每间隔6个月，需按照GB/T27417和ICHQ3D的要求开展方法学验证，验证参数及要求如下：9.1专属性：取10份不同来源的空白基质样品进行测定，无待测元素特征响应，或空白响应值低于定量限的1/3；定量限浓度加标样品回收率符合要求，判定为专属性符合要求。9.2检出限与定量限：连续测定11份试剂空白，计算响应值的标准偏差，LOD=3×SD/斜率，LOQ=10×SD/斜率。要求LOD≤限值的1/10，LOQ≤限值的1/5，且LOQ浓度下6份平行样的回收率在80%-120%之间，RSD≤10%。9.3线性与范围：标准曲线相关系数≥0.995（ICP-MS法≥0.999），线性范围需覆盖定量限至限值的2倍以上。9.4准确度：采用加标回收法验证，设置低、中、高3个加标浓度，低浓度为LOQ的2倍，中浓度为限值浓度，高浓度为限值的2倍，每个浓度制备6份平行样。回收率要求：Pb、Cd、As、Hg回收率80%-120%，Cu、Cr、Ni回收率85%-115%，RSD≤10%。9.5精密度：重复性：同一操作人员、同一台仪器、同一天内测定6份平行样品，RSD≤10%；中间精密度：不同操作人员、不同日期、不同批次试剂测定6份平行样品，RSD≤15%。9.6基质效应：采用后加标法计算基质因子，基质因子=基质加标响应值/纯溶剂加标响应值，基质因子在0.8-1.2之间判定为基质效应可忽略，否则需采用基质匹配标准曲线或标准加入法进行定量。9.7稳定性：取同一份消解液，分别在0、6、12、24、48、72h测定，浓度RSD≤10%，判定为待测液稳定性符合要求。10限量要求10.1通用限量：注射用生物制品：Pb≤0.5μg/g（μg/mL，下同），Cd≤0.3μg/g，As≤1.0μg/g，Hg≤0.1μg/g，Cr≤1.0μg/g，Ni≤1.5μg/g，Cu≤10μg/g；口服生物制品：Pb≤1.0μg/g，Cd≤0.5μg/g，As≤2.0μg/g，Hg≤0.2μg/g，Cr≤2.0μg/g，Ni≤3.0μg/g，Cu≤20μg/g；外用生物制品：Pb≤2.0μg/g，Cd≤0.5μg/g，As≤3.0μg/g，Hg≤0.5μg/g，Cr≤5.0μg/g。10.2特殊产品限量：对于给药周期超过1年的长期使用生物制品、儿童用生物制品，需结合ICHQ3D规定的每日允许暴露量（PDE）计算限值，计算公式为：限值（μg/g）=PDE（μg/天）/每日最大给药量（g/天），计算得到的限值不得高于10.1规定的通用限量。产品各论中有明确限量要求的，按各论规定执行。11结果计算与表述11.1样品中待测元素含量计算公式：X=(C1-C0)×V×f/m，其中X为样品中待测元素含量（μg/g或μg/mL），C1为样品消解液中待测元素浓度（μg/L），C0为试剂空白中待测元素浓度（μg/L），V为消解液定容体积（mL），f为测定前的稀释倍数，m为样品取样量（g或mL）。11.2结果表述：若测定值低于LOQ，表述为“<LOQ”并标注LOQ数值；若测定值高于LOQ，保留1-2位有效数字，与限量值的有效位数保持一致。12质量控制12.1每批检测需同步开展2份试剂空白试验，空白值低于LOD方可判定试验有效，否则需排查试剂、耗材污染情况，重新开展前处理。12.2每批样品至少带1份有证标准物质或加标质控样，质控样测定值在标准值的90%-110%范围内，判定为检测结果有效，否则需重新测