（正式版）DB13∕T 1080-2009 《乳及乳制品中β-内酰胺酶的测定》

X16乳及乳制品中β-内酰胺酶的测定Detectionofβ-lactamasesinmilka2009-05-27发布2009-05-27发布I本标准的附录A和附录C为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由河北省质量技术监督局提出并归口。本标准第一法由河北省食品质量监督检验研究院起草。本标准第二法由河北省食品质量监督检验研究院起草。本标准第三法由河北省科学院生物所起草。1乳及乳制品中β-内酰胺酶的测定1范围本标准规定了乳及乳制品中β-内酰胺酶的检验方法-杯碟法。2原理来间接测定样品中的β-内酰胺酶。3.4无菌培养皿：内径90mm,具陶瓦盖。3.5无菌牛津杯：外径(8.0±0.1)mm,内径(6.0±0.1)mm,高度(10.0±0.1)mm。3.6麦氏比浊仪或标准比浊管。4培养基和试剂4.1试验菌种：藤黄微球菌(Micrococcusluteu4.6舒巴坦标准溶液按附录A中A.5规定。4.7营养琼脂培养基：按附录A中A.6规定。4.9空白牛奶：按附录A中A.8规定5操作步骤5.1菌悬液的制备将藤黄微球菌接种于营养琼脂斜面上，经36±1℃培养18h～22h,用无菌生理盐水洗下菌苔即为25.2样品的制备5.3对照的制备5.3.1阴性对照，每次检验应取空白牛奶1mL加入到1.5mL离心管中共四管，分别标为：A、B、5.3.2阳性对照，取空白牛奶1mL加入到1.5mL离心管中，加入β-内酰胺酶标准溶液25μL,共做取90mm灭菌培养皿，底层加10mL灭菌的抗生素检测用培养基Ⅱ,凝固后上层加入5mL含有浓度为1×108CFU/mL藤黄微球菌的抗生素检测用培养基Ⅱ,每个检验用平板上均匀放置4个无菌牛5.5样品的测定按照下列顺序分别将青霉素标准溶液、β-内酰胺酶标准溶液、舒巴坦标准溶液加入到5.2各离心B舒巴坦25μL、青霉素5μL。各平行试验结果差异应小于2.0mm;阴性对照与阳性对照结果应符合表1实验现象，则可进行结表1实验现象对应表阴性对照阳性对照A抑菌圈直径应在20±2.0mm范围内B、D均产生抑菌圈B、D均产生抑菌圈A抑菌圈与B抑菌圈差异大于等于3.07.1样品结果同阳性对照结果实验现象一致可判定检验结果阳性。7.2如样品结果同阴性对照结果现象一致可判定检验结果阴性。31范围本标准规定了乳及乳制品中具有活性的β-内酰胺酶的高效液相色谱-串联质谱的定性检测方法。本方法对β-内酰胺酶的检测低限为4U/mL。下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本苄青霉素经乙腈-水溶液提取，提取液浓缩后，用缓冲溶液溶解，固相萃取净化，浓缩，液相色谱-质谱/质谱测定，外标法定量，通过试样中氨苄青霉素酶解率，间接定性β-内酰胺酶。4试剂4.10乙腈+水(30+70,体积比)。4.110.05mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH=7.0):称取3.4g磷酸二氢钾，超纯水溶解，稀释至1000mL,4.120.01mol/L乙酸铵溶液(pH=4.5):称取0.77g乙酸铵，超纯水溶解，稀释至1000mL,用甲酸4.13氨苄青霉素标准品：纯度大于等于95%。4.14标准储备溶液(100μg/mL):称取适量标准品(4.14),用超纯水溶解并定容至1000mL,置4.15标准工作溶液：吸取适量的氨苄青霉素标准储备液(4.15),用空白样品提取液稀释成适当浓度的基质标准工作溶液，用时现配。45仪器5.1液相色谱-质谱/质谱仪(LC-MS/MS):配有电喷雾离子源。6试样制备与保存7分析步骤7.1氨苄青霉素的加入将7.1试样置于37℃恒温水浴，酶解1h。在7.2酶解后的试样中加入20mL乙腈(4.9),均质提取30s,4000r/min低温冷冻离心5min,上清液转移至50mL离心管中；另取一离心管，加入10mL乙腈水溶液(4.9),洗涤均质器刀头，用玻璃棒捣碎离心管中的沉淀，加入上述洗涤均质器刀头溶液，在涡旋混合器上振荡1min,4000r/min低温冷冻5min,上清液合并至50mL离心管中，重复用10mL乙腈水溶液(4.9)洗涤刀头并提取一次，上清液合并至50mL离心管中，用乙腈水溶液(4.9)定容至50mL。准确移取25mL于100ml鸡心瓶。将鸡心瓶于旋转蒸发器上(37℃水浴)蒸发除去乙腈，易起沫样品可加入4迅速向已除去乙腈的鸡心瓶中加入25mL磷酸盐缓冲溶液(4.11),涡旋混匀1min,用0.1mol/L氢氧化钠调节pH为8.5,通过经过预处理的固相萃取柱，流速控制在1mL/min,先用2mL磷酸盐缓冲溶液(4.11)淋洗2次，再用1mL超纯水淋洗，然后用3mL乙腈洗脱，流速控制在1mLmin。将洗脱液于45℃下氮气吹干，用0.025mol/L磷酸盐缓冲溶液(4.12)定容至1mL,过0.22μm滤膜，供7.5.1参考色谱条件7.5.2参考质谱条件7.5.2.1离子源：电喷雾离子源。7.5.2.2扫描方式：正离子扫描。57.5.2.5雾化气压力：0.055MPa。7.5.2.6干燥气流速：10L/min。7.5.2.7离子源温度：350℃。能量电压7.5.3液相色谱-质谱/质谱测定品中存在对应的待测物。允许的最大偏差标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，标准曲线的相关系数要求不小于0.995。根据试样中被测物的含量情况，选取响应值相近的标准工作液进行单点校准，外标法计算。除不加氨苄青霉素外，均按上述操作步骤进行。8.1试样中氨苄青霉素含量的计算试样中氨苄青霉素的含量(μg/kg或μg/L):按式(1)计算X—试样中氨苄青霉素的含量，单位为微克每千克或微克每升(μg/kg或μg/L);A——试样溶液中氨苄青霉素的峰面积；AS——标准工作液中氨苄青霉素的峰面积；CS——标准工作液中氨苄青霉素的浓度，单位为微克每千克或微克每升(μg/kg或μg/L);V——试液最终定容体积，单位为毫升(mL);计算结果以平行测定值的算术平均值表示，保留3位有效数字。计算结果需折算回收率。本方法在试样中添加0.5mg/kg~2mg/kg浓度时回收率为80%～110%。Y——酶解后试样中氨苄青霉素的酶解率，单位为百分比(%);C——酶解后试样中氨苄青霉素的含量，单位为微克每千克或微克每升(μg/kg或μg/L);7本标准适用于鲜乳中β-内酰胺酶的测定。本方法对β-内酰胺酶的检测低限为5U/mL。2规范性引用文件4.1可溶性淀粉：按附录C中C.1规定。4.5青霉素钠：按附录C中C.5规定。5仪器5.5微波炉。88测定8.3取阴性对照150μL加入1个小孔中；8.5所有样品加完后，贴封口膜，置微量振荡器上振荡10分钟；8.7取出检测孔，除去封口膜，用微量移液器吸取1%的淀粉溶液，每孔加入40μL,振荡混匀；8.9振荡2分钟，观察结果。9检测注意事项10结果判定9无水磷酸二氢钾8.0g无水磷酸氢二钾2.0g蒸馏水加至1000mL121℃高压灭菌15min。准确称取适量青霉素标准物质，用磷酸盐缓冲溶液溶解并定容为0.1mg/mL的标准溶液。当天配A.5舒巴坦标准溶液准确称取适量舒巴坦标准物质，用磷酸盐缓冲溶液溶解并定容为1mg/mL的标准溶液，分装A.6营养琼脂牛肉膏氯化钠将上述成分加入蒸馏水中，搅混均匀，分装试管每管约5～8mL,120℃高压灭菌15min,灭菌后A.7抗生素检测培养基Ⅱ葡萄糖准确称取脱脂奶粉标准品2g,蒸馏水定容至20