牛血清讲课文档

牛血清第一页，共26页。一．牛血清简介

定义分类制备成分功能第二页，共26页。新生牛血清定义第三页，共26页。新生牛血清分类胎牛血清新生牛血清小牛血清成牛血清第四页，共26页。新生牛血清的制备方法出生14h内未进食的新生牛采全血自然凝集后去除红细胞分离得到血清0.45um滤膜过滤去除纤维蛋白等0.22um滤膜除菌100nm微孔滤膜三次过滤精制第五页，共26页。牛血清的成分蛋白质多肽血小板激素胰岛素促进细胞分裂类胰岛素生长因子促生长激素促细胞增殖氢化可的松促细胞贴附和增殖第六页，共26页。牛血清的功能牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。

1.提供维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。

2.提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。第七页，共26页。牛血清的功能

3.有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。

4.是细胞贴壁、铺展在培养基质上所需因子的来源。

5.对溶液起一定的缓冲液作用。

6.提供蛋白酶抑制剂，在细胞传代时，使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。

第八页，共26页。总结

牛血清在细胞培养中的主要作用（1）促进细胞生长（2）促进细胞贴壁（3）保护细胞第九页，共26页。牛血清的重要意义

牛血清是医药生物技术产品中重要的原材料，它对细胞的生长繁殖发挥着重要甚至是难以替代的作用。而细胞培养在医药领域具有特殊的作用和价值，比如基因工程药物或疫苗等在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。由此看出，细胞培养是细胞研究特别是疫苗生产的基础条件，而要做到监控生物制品成品，牛血清的质量又成为关键。第十页，共26页。二．新生牛血清质量控制

第十一页，共26页。性状、无菌、支原体淡黄色澄清稍粘稠的液体，无溶血或异物

优质血清应为淡黄色，无溶血，半透明，较粘稠，无沉淀和悬浮物的液体。判断血清质量先从外观入手：外观颜色粘稠度无菌检验：应无菌生长支原体检验：应无支原体生长第十二页，共26页。1、为什么要检测外源病毒？2、牛血清可能携带哪些外源病毒？3、检测方法？VERO/BHK21/PK15/牛睾丸细胞单层血清含量10%的MEM培养基不得出现荧光红细胞吸附内控PCR：FMDV、BPIV-3、BcoV、

BVDV、RV、CSFV、MRV、

PPV、PRV、BHV-1、MYCO外源病毒第十三页，共26页。特异性抗体的检测生产企业根据血清的使用对象确定检测的抗体种类。检测方法：中和抗体/ELISA生产口蹄疫疫苗则不得含有口蹄疫抗体。生产猪瘟疫苗则不得含有猪瘟抗体和BVDV抗体。为什么生产猪瘟疫苗要检测BVDV抗体?第十四页，共26页。BVDVＢＶＤＶ牛病毒性腹泻病病毒与猪瘟病毒同属黄病毒科瘟病毒属，因而ＢＶＤＶ中和抗体具有中和猪瘟病毒的作用。所以在猪瘟细胞苗的生产中如果使用了含有ＢＶＤＶ中和抗体的犊牛血清，将会严重干扰疫苗的正常生产，造成产品的报废和经济损失。第十五页，共26页。BVDV抗体检测方法细胞中和试验ELISA法牛病毒性腹泻抗体(BVDV-Ab)Elisa试剂盒用纯化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被单抗的微孔中依次加入牛病毒性腹泻抗体（BVDVAb），再与HRP标记的抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的病毒性腹泻抗体（BVDVAb）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中病毒性腹泻抗体（BVDVAb）浓度。第十六页，共26页。ELISA检测方法原理示意图第十七页，共26页。ELISA检测注意事项加样保温洗涤显色第十八页，共26页。内毒素内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖。脂多糖对宿主是有毒性的。各种细菌的内毒素的毒性作用较弱，大致相同，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等。内毒素耐热而稳定，抗原性弱。第十九页，共26页。内毒素检测原理第二十页，共26页。细胞增殖试验Sp2/0骨髓瘤细胞：细胞计数30万~50万/ml无血清MEM96孔细胞板1：2001:4001:8001:1600每个浓度加8孔，每孔100ul第二十一页，共26页。思考1：Cell计数：同时复苏两管1.5ml同种、同批次、理论上数量相同的细胞，相同条件下培养，连续传三代。其中一个克氏瓶加入9mlMEM培养液计数20万/ml。另一个克氏瓶加入4.5mlEME培养液，理论上细胞数量能达到多少？加入9mlMEM培养液，细胞数为20万/ml。加入4.5mlMEM培养液，细胞数为多少？第二十二页，共26页。思考2：Cell增殖：如果加入4.5mlMEM培养液计数40万/ml。实际上是否可以进行细胞增殖实验？细胞增殖条件：Sp2/0骨髓瘤细胞：细胞计数30万~50万/ml其中0.5ml用于细胞计数，3ml传代，1ml进行实验。实际操作是否符合药典相关规定？第二十三页，共26页。新生牛血清国家质控标准与美国某公司质量标准比较主要指标

国家质控标准

美国某公司产品标准

牛出生后采血时间0-14小时一周以内外观无溶血、无异物无溶血、无异物血红蛋白含量（W/V）≤0.02%≤0.02%蛋白含量（W/V）3.5-5.0%5.5-8.0%无菌试验阴性阴性内毒素≤10EU/ml≤10-15EU/ml牛腹泻病毒阴性阴性大肠杆菌噬菌体检测阴性阴性支原体检查阴性阴性细胞生长曲线测定≥10×105/ml≥10×104/ml细胞倍增时间16-20h/克隆率的检测≥50%/第二十四页，共26页。四、讨论疫苗生产中添加牛血清的种类、浓度是否可以改变？作为疫苗生产企业，公司企业